1. Pemahaman awal

Pada tahap ini, kita perlu memahami beberapa konsep dan terminologi, agar tidak terjadi kesalahan di depan senior kita, seperti:

T: Apa perbedaan antara RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, dan real-time RT-PCR?

Jawaban: RT-PCR adalah PCR transkripsi terbalik(reverse transcription PCR, RT-PCR), yang merupakan varian yang banyak digunakan dari polymerase chain reaction (PCR).Dalam RT-PCR, untai RNA ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer, yang kemudian digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi DNA oleh PCR.
Real-time-PCR dan qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) adalah hal yang sama, keduanya adalah PCR kuantitatif waktu nyata, yang berarti bahwa setiap siklus PCR memiliki catatan data waktu nyata, sehingga jumlah templat awal dapat disesuaikan dengan analisis yang tepat.

Meskipun PCR waktu nyata (PCR kuantitatif neon waktu nyata) dan PCR transkripsi terbalik (PCR transkripsi terbalik) tampaknya disingkat sebagai RT-PCR, konvensi internasionalnya adalah: RT-PCR secara khusus mengacu pada transkripsi terbalikPCR , Real-time PCR umumnya disingkat qPCR (PCR real-time kuantitatif).

Dan real-time RT-PCR (RT-qPCR), Ini adalah PCR transkripsi terbalik yang dikombinasikan dengan teknologi kuantitatif fluoresen: pertama-tama dapatkan cDNA (RT) dari transkripsi balik RNA, lalu gunakan Real-time PCR untuk analisis kuantitatif (qPCR).Sebagian besar laboratorium melakukan RT-qPCR, yaitu penelitian tentang down-regulation ekspresi RNA, jadi qPCR yang dibicarakan semua orang di laboratorium sebenarnya mengacu pada RT-qPCR, tetapi jangan lupa bahwa masih banyak tes DNA dalam aplikasi klinis.Analisis kuantitatif, seperti deteksi HBV virus hepatitis B.

Pertanyaan: Setelah membaca banyak PCR kuantitatif fluoresen, mengapa fragmen yang diamplifikasi harus dikontrol dalam kisaran 80-300bp?

Menjawab: Panjang setiap urutan gen berbeda, ada yang beberapa kb, ada yang ratusan bp, tetapi kita hanya perlu mensyaratkan panjang produk menjadi 80-300bp saat merancang primer, terlalu pendek atau terlalu panjang tidak cocok untuk deteksi PCR kuantitatif fluoresen.Fragmen produk terlalu pendek untuk dibedakan dari primer-dimer.Panjang primer-dimer sekitar 30-40bp, dan sulit untuk membedakan apakah itu primer-dimer atau produk jika kurang dari 80bp.Jika fragmen produk terlalu panjang, melebihi 300 bp, akan dengan mudah menyebabkan efisiensi amplifikasi rendah dan tidak dapat mendeteksi jumlah gen secara efektif.

Misalnya, ketika Anda menghitung berapa banyak orang di kelas, Anda hanya perlu menghitung berapa banyak mulut yang ada.Hal yang sama berlaku ketika Anda mendeteksi gen, Anda hanya perlu mendeteksi urutan gen tertentu untuk mewakili seluruh urutan.Jika Anda ingin menghitung orang, Anda perlu menghitung mulut dan hidung, telinga, dan kacamata, dan mudah membuat kesalahan.

Untuk memperluas, dalam penelitian biologi, ada banyak kasus penelitian dari titik ke daerah, karena urutan gen spesies apa pun sangat panjang, tidak perlu dan tidak mungkin untuk mengukur semua fragmen, seperti sekuensing bakteri 16S, yang melakukan tes urutan bakteri konservatif untuk menyimpulkan jumlah populasi bakteri tertentu.

T: Berapa panjang optimal untuk desain primer qPCR?

Menjawab: Secara umum, panjang primer sekitar 20-24bp, mana yang lebih baik.Tentunya kita harus memperhatikan nilai TM primer pada saat mendesain primer, karena hal ini berkaitan dengan suhu annealing yang optimal.Setelah banyak percobaan, terbukti bahwa 60°C adalah nilai TM yang lebih baik.Jika suhu anil terlalu rendah, itu akan dengan mudah menyebabkan amplifikasi non-spesifik.Jika suhu anil terlalu tinggi, efisiensi amplifikasi akan relatif rendah, puncak kurva amplifikasi akan dimulai kemudian, dan nilai CT akan tertunda.

T: Bagaimana metode pewarnaan berbeda dari metode probe?

Jawaban: Metode pewarnaanBeberapa pewarna fluoresen, seperti SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, dll., tidak memancarkan cahayanya sendiri, tetapi akan memancarkan fluoresensi setelah berikatan dengan alur kecil DNA beruntai ganda.Oleh karena itu, pada awal reaksi PCR, mesin tidak dapat mendeteksi sinyal fluoresen.Ketika reaksi mencapai tahap perpanjangan anil, untai ganda dibuka, dan untaian baru disintesis di bawah aksi DNA polimerase, dan molekul fluoresen berikatan dengan alur minor dsDNA.Dengan meningkatnya jumlah siklus PCR, semakin banyak pewarna yang digabungkan dengan DNA beruntai ganda, dan sinyal fluoresen juga terus ditingkatkan.Metode pewarna terutama digunakan dalam penelitian ilmiah.
PS: Hati-hati saat melakukan percobaan, pewarna harus digabungkan dengan DNA manusia, hati-hati mengubahnya menjadi orang yang berpendar.

Metode pewarna (kiri) Metode probe (kanan)
PS: Hati-hati saat melakukan percobaan, pewarna harus digabungkan dengan DNA manusia, hati-hati mengubahnya menjadi orang yang berpendar.

SYBR Green Ⅰ berikatan dengan alur minor DNA

Metode penyelidikanProbe Taqman adalah probe hidrolisis yang paling umum digunakan.Ada kelompok fluoresen di ujung 5' probe, biasanya FAM, dan probe itu sendiri merupakan urutan yang melengkapi gen target.Ada grup quenching fluoresen di ujung 3′.Menurut prinsip transfer energi resonansi fluoresensi (Transfer energi resonansi Förster, FRET), ketika kelompok fluoresen reporter (molekul fluoresen donor) dan kelompok fluoresensi quenching (molekul fluoresen akseptor) tereksitasi Ketika spektrum tumpang tindih dan jaraknya sangat dekat (7-10nm), eksitasi molekul donor dapat menginduksi fluoresensi molekul akseptor, sementara autofluoresensi melemah.Oleh karena itu, pada awal reaksi PCR, ketika probe bebas dan utuh dalam sistem, gugus fluoresen pelapor tidak akan memancarkan fluoresensi.Saat anil, primer dan probe mengikat ke template.Selama tahap ekstensi, polimerase terus mensintesis rantai baru.DNA polimerase memiliki aktivitas eksonuklease 5′-3′.Saat mencapai probe, DNA polimerase akan menghidrolisis probe dari template, memisahkan kelompok fluoresen reporter dari kelompok fluoresen quencher, dan melepaskan sinyal fluoresen.Karena ada hubungan satu-ke-satu antara probe dan template, metode probe lebih unggul daripada metode pewarna dalam hal akurasi dan sensitivitas pengujian.Metode probe terutama digunakan dalam diagnosis.

T: Apa itu kuantifikasi absolut?Apa itu Kuantifikasi Relatif?

Menjawab: Kuantifikasi absolut mengacu pada perhitungan jumlah salinan awal sampel yang akan diuji oleh qPCR, seperti berapa banyak virus HBV dalam 1ml darah.Hasil yang diperoleh dengan kuantifikasi relatif adalah perubahan jumlah gen target dalam sampel spesifik relatif terhadap sampel referensi lain, dan ekspresi gen diatur naik atau turun.

T: Apakah jumlah ekstraksi RNA, efisiensi transkripsi balik, dan efisiensi amplifikasi akan memengaruhi hasil eksperimen?
T: Apakah penyimpanan sampel, reagen ekstraksi, reagen transkripsi balik, dan bahan habis pakai transmisi cahaya akan memengaruhi hasil eksperimen?
T: Metode apa yang dapat memperbaiki data percobaan?

Mengenai masalah ini, kami akan menjelaskannya secara rinci di bagian lanjutan dan lanjutan di bawah ini.
2. Pengetahuan tingkat lanjut

Sehubungan dengan PCR kuantitatif fluoresen waktu-nyata, kita harus mengakui kenyataan bahwa ribuan makalah penelitian ilmiah diterbitkan setiap tahun, di antaranya teknologi PCR kuantitatif fluoresen bukanlah jumlah yang kecil.

Jika tidak ada standar umum untuk mengukur percobaan PCR kuantitatif fluoresen, hasilnya dapat sangat bervariasi.Untuk gen yang sama dari spesies yang sama, dengan metode pemrosesan yang sama, hasil deteksi juga akan sangat bervariasi, dan akan sulit bagi pendatang baru untuk mengulangi hasil yang sama.Anda Tidak ada yang tahu mana yang benar dan mana yang salah.

Apakah ini berarti PCR kuantitatif fluoresen adalah teknologi curang atau teknologi yang tidak dapat diandalkan?Tidak, itu karena PCR kuantitatif fluoresen lebih sensitif dan lebih akurat, dan operasi yang sedikit salah akan menghasilkan hasil yang sangat berlawanan.Kerugian kecil berjarak seribu mil jauhnya.Penulis artikel mungkin berulang kali disiksa oleh para peninjau.Pada saat yang sama, peninjau jurnal juga sulit untuk memilih dari hasil eksperimen yang berbeda.

Secara keseluruhan, menunjukkan kurangnya konsensus dalam percobaan PCR waktu nyata.Untuk tujuan ini, para ilmuwan senior di industri mulai merumuskan standar,membutuhkan kontributor untuk memberikan beberapa detail pemrosesan eksperimental dan data yang diperlukan (termasuk data yang diperlukan) dalam artikel untuk memenuhi standar ini.

Peninjau dapat menilai kualitas eksperimen dengan membaca detail ini;pembaca masa depan juga dapat menggunakan ini untuk mengulangi percobaan atau meningkatkan percobaan.Kemudian hasil percobaan yang diperoleh dengan cara ini penuh dengan informasi, berkualitas tinggi, dan bermanfaat.

MIBBI (Informasi Minimum untuk Investigasi Biologis dan Biomedis -http://www.mibbi.org) muncul.MIBBI adalah proyek yang menyediakan standar untuk eksperimen.Itu diterbitkan di alam.Proyek ini ditujukan untuk berbagai eksperimen biologi, termasuk biologi sel, Microarray, qPCR yang akan kita diskusikan sekarang, dll., dan menyediakan setiap jenis eksperimen saat mengirimkan manuskrip.Informasi itu harus diberikan setiap saat.

Dalam proyek MIBBI, ada dua artikel terkait PCR kuantitatif fluoresen, yaitu:
·RDML (Bahasa Markup Data PCR Real-Time) – bahasa terstruktur dan panduan pelaporan untuk data PCR kuantitatif waktu nyata;
·MIQE (Informasi Minimum untuk Publikasi Eksperimen PCR Real-Time Kuantitatif) – informasi minimum untuk menerbitkan artikel tentang eksperimen PCR kuantitatif real-time.
Pertama, mari kita bicara tentang RDML, spesifikasi terminologi.

Jika tidak ada definisi standar untuk semuanya, tidak mungkin melanjutkan diskusi, oleh karena itu penjelasan istilah sangat penting dalam ujian.
Terminologi yang digunakan dalam percobaan PCR kuantitatif fluoresen mencakup konten berikut.QIAGEN telah membuat ringkasan terbaik untuk kami.Berikut ini semuanya keringbarang-barang .

Kurva amplifikasi
Kurva amplifikasi mengacu pada kurva yang dibuat selama proses PCR, dengan nomor siklus sebagai absis dan intensitas fluoresensi real-time selama reaksi sebagai ordinat.

Kurva amplifikasi yang sangat baik harus memiliki karakteristik sebagai berikut: baseline datar atau sedikit menurun, dan tidak ada tren naik yang jelas;titik belok kurva jelas, dan kemiringan fase eksponensial sebanding dengan efisiensi amplifikasi.Semakin besar kemiringan, semakin tinggi efisiensi amplifikasi;kurva amplifikasi keseluruhan Paralelismenya bagus, menunjukkan bahwa efisiensi amplifikasi setiap tabung serupa;fase eksponensial dari kurva amplifikasi sampel konsentrasi rendah terlihat jelas.

Dasar (Dasar)
Baseline adalah tingkat kebisingan dari siklus awal, biasanya diukur antara siklus ke-3 dan ke-15, karena peningkatan nilai fluoresensi yang disebabkan oleh produk amplifikasi tidak dapat dideteksi selama periode ini.Jumlah siklus yang digunakan untuk menghitung garis dasar dapat bervariasi dan mungkin perlu dikurangi jika jumlah templat yang digunakan tinggi atau jika tingkat ekspresi gen target tinggi.

Menetapkan baseline memerlukan melihat data fluoresensi dari kurva amplifikasi linearitas.Baseline diatur sehingga pertumbuhan kurva amplifikasi dimulai dengan nomor siklus yang lebih besar dari nomor atas siklus baseline.Baseline perlu ditetapkan secara individual untuk setiap urutan target.Nilai fluoresensi rata-rata yang terdeteksi pada siklus awal perlu dikurangi dari nilai fluoresensi yang diperoleh pada produk yang diamplifikasi.Versi terbaru dari berbagai perangkat lunak Real-Time PCR memungkinkan pengoptimalan otomatis pengaturan garis dasar untuk masing-masing sampel.

Selama beberapa siklus pertama reaksi amplifikasi PCR, sinyal fluoresensi tidak banyak berubah.Mendekati garis lurus disebut garis dasar, tetapi jika kita melihat lebih dekat pada beberapa siklus pertama, kita melihat bahwa di dalam garis dasar itulah yang terjadi pada gambar di bawah.

Latar Belakang Latar belakang mengacu pada
nilai fluoresensi non-spesifik dalam reaksi.Misalnya: pendinginan fluoresensi yang tidak efisien;atau sejumlah besar templat DNA beruntai ganda karena penggunaan SYBR Green.Komponen latar belakang sinyal secara matematis dihilangkan oleh algoritme perangkat lunak Real-Time PCR.

Sinyal reporter
Sinyal reporter mengacu pada sinyal fluoresen yang dihasilkan oleh SYBR Green atau probe urutan-spesifik berlabel fluoresen selama PCR Real-Time.

Sinyal Reporter yang Dinormalkan (RN)
RN mengacu pada intensitas fluoresensi pewarna reporter dibagi dengan intensitas fluoresensi pewarna referensi pasif yang diukur pada setiap siklus.

Pewarna Referensi Pasif
Dalam beberapa PCR Real-Time,pewarna fluoresen ROX digunakan sebagai referensi internal untuk menormalkan sinyal fluoresen.Ini mengoreksi variasi karena pemipetan yang tidak akurat, posisi sumur, dan fluktuasi fluoresensi dengan basis sumur-demi-sumur.

Ambang fluoresensi (ambang batas)
disesuaikan di atas nilai latar belakang dan secara signifikan di bawah nilai dataran tinggi kurva amplifikasi.Itu harus terletak di wilayah linier dari kurva amplifikasi, yang mewakili rentang log-linear dari deteksi PCR.Ambang batas harus diatur dalam tampilan kurva amplifikasi log sehingga fase log-linier PCR mudah diidentifikasi.Jika ada beberapa gen target dalam Real-Time PCR, ambang batas harus ditetapkan untuk setiap target .Secara umum, sinyal fluoresensi dari 15 siklus pertama reaksi PCR digunakan sebagai sinyal latar belakang fluoresensi, dan ambang fluoresensi adalah 10 kali standar deviasi sinyal fluoresensi dari 3 hingga 15 siklus pertama PCR, dan ambang fluoresensi diatur dalam fase eksponensial amplifikasi PCR.Secara umum, setiap instrumen memiliki ambang fluoresensi yang ditetapkan sebelum digunakan.

Ambang Batas Siklus (CT) atau Titik Penyeberangan (CP)
Siklus di mana kurva amplifikasi melintasi ambang (yaitu, titik di mana deteksi fluoresensi meningkat secara signifikan).CT dapat berupa pecahan dan jumlah templat awal dapat dihitung.Nilai CT mewakili jumlah siklus yang dialami ketika sinyal fluoresen di setiap tabung reaksi PCR mencapai ambang batas yang ditetapkan.Terdapat hubungan linier antara nilai CT setiap template dengan logaritma nomor salinan awal template, yaitusemakin tinggi nomor salinan awal, semakin kecil nilai CT, begitu pula sebaliknya.Kurva standar dapat dibuat dengan menggunakan standar dengan nomor salinan awal yang diketahui, di mana absis mewakili nilai CT, dan ordinat mewakili logaritma nomor salinan awal.Oleh karena itu, selama nilai CT dari sampel yang tidak diketahui diperoleh, jumlah salinan awal sampel dapat dihitung dari kurva standar.

nilai ΔCT
Nilai ΔCT menjelaskanperbedaan antara gen target dan nilai CT gen referensi endogen yang sesuai, seperti gen rumah tangga, dan digunakan untuk menormalkan jumlah templat yang digunakan:
⇒ΔCT = CT (gen target) – CT (gen referensi endogen)

Nilai ΔΔCT
Nilai ΔΔCT menggambarkan perbedaan antara nilai rata-rata ΔΔCT dari sampel yang diminati (misalnya, sel yang distimulasi) dan nilai rata-rata ΔΔCT dari sampel referensi (misalnya, sel yang tidak distimulasi).Sampel referensi juga disebut sampel kalibrasi dan semua sampel lainnya dinormalisasi untuk kuantifikasi relatif:
⇒ΔΔCT = rata-rata ΔCT (sampel minat) – rata-rata ΔCT (sampel referensi)

Gen referensi endogen (gen referensi endogen)
Tingkat ekspresi gen referensi endogen, seperti gen rumah tangga (housekeeping gen), tidak berbeda antar sampel.Membandingkan nilai CT gen referensi dengan gen target memungkinkan tingkat ekspresi gen target dinormalisasi dengan jumlah input RNA atau cDNA (lihat bagian tentang nilai ΔCT di atas).

Gen referensi internal yang benar untukkemungkinan degradasi RNA atau adanya penghambat enzim dalam sampel RNA, serta variasi konten RNA, efisiensi transkripsi terbalik, pemulihan asam nukleat, dan penanganan sampel.Untuk memilih gen referensi optimal, kami memodifikasi algoritme untuk memungkinkan pemilihan referensi optimal bergantung pada pengaturan eksperimental.

Kontrol internal
Urutan kontrol yang diperkuat dalam reaksi yang sama dengan urutan target dan diperiksa dengan pemeriksaan yang berbeda (yaitu, melakukan PCR dupleks).Kontrol internal sering digunakan untuk mengesampingkan amplifikasi gagal, seperti ketika urutan target tidak terdeteksi.
Contoh Kalibrasi
Sampel referensi (misalnya, RNA murni dari garis sel atau jaringan) yang digunakan dalam kuantifikasi relatif untuk membandingkan semua sampel lain guna menentukan tingkat ekspresi relatif suatu gen.Sampel kalibrasi dapat berupa sampel apa pun, tetapi biasanya merupakan kontrol (misalnya, sampel yang tidak diolah atau sampel dari waktu nol percobaan).

Kontrol positif
menggunakan reaksi kontrol denganjumlah cetakan yang diketahui.Kontrol positif sering digunakan untuk memeriksa bahwa set primer atau set probe primer bekerja dengan benar dan reaksi diatur dengan benar.

Tanpa Kontrol Templat (NTC)
Reaksi kontrol yang berisi semua komponen yang diperlukan dari reaksi amplifikasi kecuali template, yang biasanya diganti dengan air.Penggunaan NTC dapat menemukan kontaminasi yang disebabkan oleh kontaminasi reagen atau DNA asing, sehingga memastikan keaslian dan keandalan data pendeteksian.Amplifikasi kontrol NTC menunjukkan kontaminasi.

Tidak ada kontrol RT (NRT)
Proses ekstraksi RNA mungkin mengandung sisa DNA genomik, yang sangat berbahaya dan merupakan biang keladi yang mempengaruhi kualitas data dan musuh alami qPCR, jadi saat merancang percobaan, itu harus dirancang hanya untuk memperkuat deteksi RNA.Ada dua cara, satu adalah merancang primer melintasi intron, yang lain adalah menghilangkan DNA sepenuhnya, mana yang lebih baik, yang akan dibahas nanti.Kontrol NTR adalah cermin ajaib untuk mendeteksi polusi DNA.Jika ada amplifikasi, berarti ada polusi.

Standar
Standar adalah sampel dengan konsentrasi yang diketahui atau nomor salinan yang digunakan untuk membuat kurva standar.Untuk memastikan stabilitas standar, fragmen gen biasanya diklon ke dalam plasmid dan digunakan sebagai standar.

Kurva standar
biasanya diencerkan menjadi setidaknya 5 gradien konsentrasi dengan produk standar sesuai dengan rasio penggandaan, dan 5 titik digambar dalam koordinat nilai CT dan nomor salinan, dan titik-titik tersebut dihubungkan untuk membentuk garis untuk menghasilkan kurva standar.Untuk setiap kurva standar, validitasnya perlu diperiksa.Nilai kemiringan berada di antara –3,3 dan –3,8, dan setiap konsentrasi dilakukan dalam rangkap tiga.Poin yang berbeda secara signifikan dari poin lainnya harus dibuang.Nilai CT sampel yang akan diuji dimasukkan ke dalam kurva standar, dan tingkat ekspresi sampel yang akan diuji dapat dihitung.

Nilai CT dari sampel yang akan diuji dimasukkan ke dalam kurva standar, dan jumlah salinan awal dari sampel yang akan diuji dapat dihitung.

Efisiensi dan Kemiringan
Kemiringan kurva standar mewakili efisiensi PCR waktu nyata.
· Kemiringan -3,322 menunjukkan bahwa efisiensi amplifikasi PCR adalah 1, atau 100% efisien, dan jumlah produk PCR berlipat ganda pada setiap siklus.
·Kemiringan kurang dari –3,322 (misalnya, –3,8) menunjukkan efisiensi PCR
· Kemiringan yang lebih besar dari –3,322 (misalnya, –3,0) menunjukkan bahwa efisiensi PCR tampaknya lebih besar dari 100%, yang mengherankan, bagaimana mungkin satu siklus PCR menghasilkan produk amplifikasi lebih dari dua kali lipat?Situasi ini terjadi pada fase non-linear dari reaksi PCR, yaitu amplifikasi non-spesifik dalam jumlah besar.

kurva leleh
Setelah amplifikasi qPCR selesai, produk PCR dipanaskan.Saat suhu naik, produk amplifikasi beruntai ganda secara bertahap meleleh, menghasilkan penurunan intensitas fluoresensi.Ketika suhu tertentu (Tm) tercapai, sejumlah besar produk akan meleleh.Fluoresensi turun tajam.Produk PCR yang berbeda memiliki nilai Tm yang berbeda dan suhu leleh yang berbeda, sehingga spesifisitas PCR dapat diketahui.

Kurva leleh (kurva turunan)
Kurva peleburan diturunkan untuk membentuk peta puncak, yang dapat menampilkan situasi fragmen produk PCR secara lebih intuitif.Karena suhu leleh adalah nilai Tm dari fragmen DNA, beberapa parameter yang mempengaruhi nilai Tm dari fragmen DNA dapat dinilai, seperti ukuran fragmen, kandungan GC, dll. Secara umum, menurut prinsip desain primer kami,panjang produk yang diperkuat berada di kisaran 80-300bp, sehingga suhu leleh harus antara 80°C dan 90°C.

Interpretasi kurva leleh: Jika satu-satunya puncak utama muncul antara 80°C-90°C, itu berarti PCR kuantitatif fluoresen sempurna;jika puncak utama muncul antara 80°C-90°C dan puncak lain-lain muncul di bawah 80°C, dimer primer pada dasarnya dipertimbangkan.Anda dapat mencoba menaikkan suhu anil untuk mengatasinya;jika puncak utama muncul antara 80°C-90°C, dan puncak lain-lain muncul lagi saat suhu naik, pada dasarnya dianggap ada kontaminasi DNA, dan DNA perlu dihilangkan pada tahap awal percobaan.

Tentunya masih ada beberapa situasi abnormal yang akan diuraikan satu per satu di bawah ini.
3. Pengetahuan tingkat lanjut

Untuk melakukan qPCR, saya harus mengatakan MIQE,Informasi Minimaluntuk Publikasi dariKuantitatifPCR Waktu NyataEksperimen — informasi minimum untuk menerbitkan artikel tentang PCR kuantitatif waktu nyataeksperimen.Untuk menyederhanakan pemahaman semua orang, kami akan menyederhanakan konten utama.

Anda dapat mencari teks asli MIQE di Internet, dan yang paling penting adalah menetapkandaftar periksa data yang perlu disediakan saat menerbitkan artikel .

Peninjau dapat menilai kualitas eksperimen dengan membaca detail ini;pembaca masa depan juga dapat menggunakan ini untuk mengulang atau meningkatkan percobaan.
Perlu dicatat bahwa dalam daftar ini, pentingnya setiap daftar ditandai dengan E atau D masing-masing.Apa artinya?E: informasi penting (harus diserahkan);D: informasi yang diinginkan (berikan sebanyak mungkin).

MIQE (1)—Desain Eksperimental
Banyak bajingan yang telah menyelesaikan pertahanan mereka setelah menyelesaikan studi pascasarjana mereka tidak akan tahu bagaimana merancang eksperimen secara mandiri, membuka buku catatan mereka, dan melakukan apa yang diperintahkan oleh guru mereka.Akibatnya, desain eksperimentalnya tidak ketat, dan departemen editorial majalah tersebut mengatakan bahwa mereka ingin mengarang gambar ini dan itu, jadi mereka melakukannya dengan linglung.Beginilah cara bajingan dibuat!

Lebih dekat ke rumah, prinsip pertama percobaan adalah menentukankekakuan logika eksperimental.Hal yang paling mendasar adalah desain eksperimen, dan yang terpenting dari desain eksperimen adalah bagaimana menetapkan sampel target, sampel referensi (kontrol), dan jumlah pengulangan, sehingga data eksperimen dapat dirujuk, dibandingkan, dan meyakinkan.

Sampel sasaranmengacu pada sampel yang mengharuskan kita untuk mendeteksi gen target setelah pengobatan tertentu.Sampel referensiadalah sampel tanpa perlakuan apapun, yang sering disebut sebagai tipe liar dalam biologi.

Ulangan eksperimentalsangat penting.Umumnya, jumlah ulangan persuasif harus lebih dari tiga.Penting untuk membedakan apa itu replikasi biologis dan apa itu replikasi teknis.

Replika Biologis: Eksperimen verifikasi yang sama dilakukan dengan bahan yang berbeda (waktu, tanaman, batch, pelat reaksi).

duplikasi biologis
Mari kita ambil perlakuan pestisida pada lada sebagai contoh.Kami ingin menyemprotkan pestisida pada tiga tanaman ABC, maka tiga tanaman ABC adalah tiga ulangan biologis, dan percobaan verifikasi yang sama dilakukan dengan bahan yang berbeda.Namun sebagai percobaan pasti diperlukan suatu kontrol, sehingga kita dapat menyemprot salah satu cabang tanaman A untuk membentuk kelompok percobaan tanaman A, dan tidak menyemprot cabang tanaman A yang lain untuk membentuk kelompok kontrol.Lakukan hal yang sama untuk B dan C.

Replika Teknis (Replika Teknis): Ini adalah percobaan berulang yang dirancang untuk menghindari kesalahan yang disebabkan oleh pengoperasian, yang sebenarnya merupakan lubang duplikat yang termasuk dalam bahan yang sama.Baik perlakuan maupun kontrol harus memiliki pengaturan replikasi (minimal tiga) dari gen target dan gen referensi internal.

Pengulangan teknis
Ambil lada yang diberi pestisida sebagai contoh lagi.Untuk kelompok percobaan tanaman A, kami membuat tiga lubang PCR masing-masing 1, 2, dan 3 untuk gen target dan gen referensi internal, untuk diambil rata-ratanya setelah deteksi.Untuk kontrol tanaman A Golongan juga diperlakukan dengan cara yang sama.Demikian pula, lakukan perlakuan yang sama untuk tanaman B dan C.Ini adalah pengulangan teknis.

Perlu dicatat bahwayang masuk dalam statistik adalah pengulangan biologis, dan pengulangan teknis adalah untuk menguji apakah ada fenomena acak dalam proses percobaan, sehingga membuat hasil percobaan kredibel, yaitu menghindari kesalahan dengan mengambil rata-ratanya seperti yang sering kita katakan.

Kontrol Negatif—NTC dan NRT
NTC (Kontrol Tanpa Template), kontrol tanpa templat, digunakan untuk memverifikasi apakah bahan eksperimen terkontaminasi.Umumnya, air digunakan sebagai templat.Jika terjadi reaksi fluoresen, itu menandakan telah terjadi kontaminasi asam nukleat di laboratorium.

Polusi ini berasal dari: air tidak murni, reagen tidak memenuhi syarat yang mengandung DNA endogen, polusi primer, polusi peralatan laboratorium, polusi aerosol, dll., perlu menggunakan pemulung RNase dan inhibitor RNase.Polusi aerosol adalah yang paling sulit ditemukan.Bayangkan laboratorium Anda seperti kabut asap, dengan berbagai asam nukleat tersuspensi di udara.

NRT (Tanpa-Reverse Transcriptase), kontrol tanpa transkripsi balik, adalah RNA transkripsi non-balik sebagai kontrol negatif, yang merupakan kontrol residu gDNA.

Saat melakukan ekspresi gen, jumlah RNA dideteksi dengan mendeteksi jumlah cDNA setelah transkripsi balik.Jika terdapat residu gDNA pada saat pemurnian RNA, maka akan menyebabkan kesalahan pada hasil percobaan, karena sebenarnya hasil yang diperoleh adalah gDNA dan cDNA.Pada tingkat agregat, bukan hanya cDNA, gDNA perlu dihilangkan seluruhnya selama ekstraksi RNA.

MIQE (2)—informasi sampel
Apa yang disebut informasi sampel berarti bahwa ketika kami menerbitkan artikel tentang qPCR, kami harus menjelaskan informasi sampel dengan jelas, yang merupakan bagian tak terpisahkan dari artikel tersebut.Demikian pula, saat kami memproses sampel, kami juga harus mengatur operasi kami sendiri untuk memastikan validitas sampel.

Deskripsi sampel hanyalah hasil, dan kita harus lebih memperhatikan bahan yang diambil selama seluruh percobaan.

Pemilihan bahan percobaan
Sampel darah – pilih darah segar, tidak lebih dari 4 jam.Sampel sel – pilih untuk mengumpulkan sel segar dalam periode pertumbuhan yang kuat.Jaringan Hewan—Pilih jaringan yang segar dan tumbuh subur.Jaringan Tumbuhan – Pilih jaringan muda yang segar.

Anda pasti memperhatikan bahwa ada kata kunci dalam beberapa kalimat ini: fresh .
Untuk sampel di atas, kit terbaik, hemat biaya, dan stabil di pasaran adalah kit Foregene, yang dapat dengan cepat dan mudah mengekstraksi DNA dan RNA mereka.

Kit Mini DNA Darah

Kit Isolasi RNA Total Sel

Kit Isolasi RNA Total Hewan

Kit Isolasi RNA Total Tanaman

Tanam Total RNA Isolasi Kit Plus

Kit Isolasi DNA Tanaman

penyimpanan bahan percobaan
Secara umum, kami tidak menyarankan penyimpanan sampel, jika kondisinya memungkinkan.Namun, banyak teman yang tidak dapat langsung melakukan percobaan setelah pengambilan sampel, bahkan ada yang harus membawa tangki nitrogen cair ke lapangan untuk pengambilan sampel.

Untuk teman pekerja keras seperti ini, saya hanya bisa mengatakan bahwa Anda tidak mengerti bahan habis pakai reagen.Sekarang banyak perusahaan bahan habis pakai reagen memproduksi reagen yang dapat menyimpan sampel RNA pada suhu kamar, dan Anda dapat memilih untuk menggunakannya.Metode penyimpanan konvensional adalah penyimpanan nitrogen cair, menggunakan tangki nitrogen cair kecil yang mudah dibawa.Setelah membawa sampel kembali ke laboratorium, simpan dalam lemari es -80°C.

Untuk eksperimen yang melibatkan RNA, prinsip enam kata harus diikuti:suhu rendah, tidak ada enzim,Dancepat .

Konsep suhu rendah mudah dipahami;tanpa enzim, RNase ada di mana-mana di dunia tempat kita tinggal (jika tidak, Anda akan terbunuh oleh HIV), jadi bagaimana menghindari RNase saat melakukan eksperimen adalah konsep yang sangat penting;cepat,Tidak ada Kung Fu di dunia ini yang tidak bisa dipatahkan, hanya kecepatan yang tidak bisa dipatahkan.

Oleh karena itu, dalam artian, semakin pendek waktu ekstraksi, semakin baik kitnya.KenapaForegenekit menekankan kecepatan, karena mereka mengetahuinya dengan baik.

PS: Beberapa gadis melakukan eksperimen dengan sangat hati-hati, tetapi mereka tidak sebagus slam dunk setelah beberapa tahun bekerja.Mereka merasa bahwa Tuhan tidak adil, mengeluh tentang orang lain, dan mencari kehidupan.Nyatanya, dia tidak memahaminya.Dia tidak melindungi RNA dengan baik, dan pemain slam dunk itu gesit.Ketika dia melakukan percobaan, dia berpikir bahwa dia akan menyelesaikan slam dunk dengan tiga kali, lima kali dan dua pembagian, tetapi dia melakukan percobaan dengan baik.

Catatan: Lebih lambat, lebih banyak kemungkinan invasi RNase.Bagaimana cara melatih diri agar cepat?Tidak mungkin, hanya berlatih lebih banyak.

Untuk percobaan yang berbeda dan sampel yang berbeda, masih perlu membaca lebih banyak literatur dan memilih metode pemrosesan yang tepat.Untuk proses pengumpulan dan penyimpanan sampel, MIQE mensyaratkan bahwa itu harus ditulis dengan jelas di makalah, sehingga peninjau dapat meninjau keandalan makalah, dan juga nyaman bagi anak muda yang terpana untuk mengulangi percobaan Anda.

Meskipun eksperimen biologis itu sulit, eksperimen itu canggih.Jika Anda tidak berhati-hati, Anda dapat menjungkirbalikkan dunia.Misalnya membuat SARS menjadi krisis biokimia, atau membuat beras hibrida untuk menyelamatkan 1,3 miliar orang.Gambar di bawah ini adalah eksperimen kimia, Anda harus memahami betapa bangganya Anda dengan penelitian Anda hanya dengan melihat penampilannya yang seperti penis.Lupakan saja, jangan hitam dia.

MIQE (3) – ekstraksi asam nukleat.
Ekstraksi asam nukleat adalah peristiwa besar, dan semua eksperimen biologi molekuler dimulai dengan ekstraksi asam nukleat.Pertama-tama, mari kita salin konten MIQE tentang ekstraksi asam nukleat.

Melihat bentuk ini, Anda tidak bisa tinggal di permukaan.Bentuknya adalah dogma.Untuk menjadi siswa top, Anda harus bertanya mengapa.Isi penting dari tabel ini adalah: Kejarkemurnian, integritas, konsistensi, dan jumlah ekstraksi RNA .

Bagian pertama dariproses atau instrumen adalah langkah ekstraksi asam nukleat.Jika Anda menggunakan ekstraktor asam nukleat otomatis untuk mengekstrak (lanjutan, silakan hubungi saya untuk pembelian), Anda perlu menunjukkan nama model instrumen.

Nama kit dan

kit apa yang digunakan untuk perincian perubahan, reagen khusus apa yang ditambahkan atau operasi khusus apa yang dilakukan harus dijelaskan dengan jelas sehingga orang lain dapat dengan mudah mengulangi eksperimen Anda.

Beberapa orang menambahkan beberapa reagen khusus saat mengekstraksi sampel khusus, mengira ini adalah senjata rahasia mereka dan tidak memberi tahu orang lain.Sambil merahasiakannya, mereka juga kehilangan kesempatan untuk membuat artikel Anda bersinar.Jangan pintar, kamu harus lebih jujur ​​​​daripada Zhang tua negara dalam penelitian ilmiah, jika kamu ingin pintar, artikel itu akan membuatmu bodoh.

harus mengingat nomor produk kitketika Anda memesan kit dan menulis artikel.Biasanya ada dua nomor pada kit: Cat—nomor katalog (nomor produk, nomor artikel), Lot—nomor lot produk (Digunakan untuk menunjukkan dari batch mana produk berasal).

Selain itu, nomor CAS sering digunakan saat memesan reagen biokimia, dan saya akan mempopulerkannya bersama.Nomor CAS adalah nomor yang diberikan oleh American Chemical Society untuk setiap obat kimia baru.Umumnya, tiga angka dihubungkan dengan tanda hubung.Nomor CAS Rushui: 7732-18-5.Bahan kimia sering kali memiliki banyak alias, tetapi nomor CAS-nya unik.Saat memesan obat, Anda bisa mengecek nomor CAS-nya terlebih dahulu.

Lebih dekat ke rumah, mengapa kita harus menggambarkan hal-hal ini dengan jelas?Bahkan, juga untuk memeriksa kualitas ekstraksi RNA.Penggunaan instrumen dan kit akan membuat ekstraksi RNA lebih konsisten.Skala ekstraksi laboratorium biasa tidak besar, dan dapat diperoleh dengan kit.

Detail pengobatan DNase atau RNase
Masalah penting PCR kuantitatif fluoresen adalah untuk mencegah kontaminasi DNA, dan jangan bereksperimen jika ada kontaminasi.Oleh karena itu, sangat penting untuk menyatakan proses yang Anda gunakan untuk memproses DNA, untuk menunjukkan bahwa DNA dalam proses percobaan telah dihilangkan seluruhnya.diwakili oleh diagram skematik.

Diagram skematik RNA dan DNA
Secara umum, metode untuk menghilangkan DNA adalah memperlakukan RNA dengan DNase setelah ekstraksi.Namun, ini adalah metode yang relatif lama.Kit ekstraksi RNA komersial telah mampu menghilangkan DNA selama proses ekstraksi tanpa menambahkan DNase.Misalnya rangkaian kit dari Foregene .

Catatan: Menghapus DNA selama ekstraksi RNA adalah pedang bermata dua yang sangat berbahaya, yang akan memperpanjang waktu operasi ekstraksi RNA dan meningkatkan risiko degradasi RNA.Pada dasarnya, ini adalah trade-off antara hasil RNA dan kemurnian.

Selain itu, jumlah DNase yang ditambahkan ke kolom adsorpsi berbasis silika sangat kecil, dan DNase berkualitas tinggi harus digunakan untuk mencapai efeknya.DNase yang tidak dioptimalkan tidak dapat dicerna dengan cepat dan lengkap.Ini adalah ujian tingkat teknis pedagang.Tentu saja, ada lebih banyak pedagang aneh yang menyombongkan diri bahwa DNA dapat dihilangkan tanpa DNase.Dapat dikatakan bahwa siapa pun yang menyombongkan diri bahwa DNA dapat dihilangkan seluruhnya tanpa DNase adalah seorang hooligan.DNA adalah struktur beruntai ganda yang relatif stabil, dan tidak dapat dihapuskan hanya dengan berbicara dan tertawa.

Penilaian kontaminasi
metode penilaian: deteksi elektroforesis, agarosa 1%, 6V/cm, 15 menit, memuat 1-3 ul

Analisis kuantitatif asam nukleat
biasanya diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV.Izinkan saya mempopulerkan dulu arti dari ketiga nilai OD260, OD280, dan OD230.
· OD260nm: Ini adalah panjang gelombang serapan dari puncak serapan tertinggi asam nukleat, dan nilai pengukuran terbaik berkisar antara 0,1 hingga 1,0.Jika tidak, encerkan atau konsentrasikan sampel agar berada dalam jangkauan.
·OD280nm: Ini adalah panjang gelombang serapan dari puncak serapan tertinggi dari zat protein dan fenolik.
·OD230nm: Ini adalah panjang gelombang serapan dari puncak serapan karbohidrat tertinggi.

Selanjutnya, mari kita bicara tentang peran masing-masing indikator.Untuk A260, dapat digunakan untuk mengukur hasil asam nukleat.Saat OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Untuk kemurnian, kita perlu melihat rasio yang biasa kita lihat: OD260/280 dan OD260/230.
·DNA murni: OD260/280 kira-kira sama dengan 1,8.Bila lebih besar dari 1,9 berarti ada pencemaran RNA, dan bila kurang dari 1,6 berarti ada pencemaran protein dan fenol.
· RNA Murni: 1.7
·OD260/230: Apakah itu DNA atau RNA, nilai referensinya adalah 2,5.Bila kurang dari 2,0, berarti ada pencemaran gula, garam dan bahan organik.

integritas RNA

Sangat penting untuk mengukur integritas RNA.Secara umum, perlu dilakukan percobaan gel denaturasi RNA untuk memeriksa apakah kecerahan antara 28S dan 18S RNA adalah hubungan dua kali lipat.Ketika band ketiga 5S muncul, berarti RNA sudah mulai terdegradasi, kecuali invertebrata.

Data untuk penilaian kualitas RNA: Selain tes di atas, ada juga beberapa tes instrumen yang lebih canggih dalam hal integritas RNA, seperti tes integritas RQI dari sistem elektroforesis otomatis Experion, yang dapat mendeteksi apakah RNA terdegradasi secara kasat mata.

Dalam penelitian ilmiah, PCR kuantitatif fluoresen adalah perbandingan antara gen target dan gen referensi internal.Oleh karena itu, dalam proses pengawetan sampel RNA, ekstraksi RNA, dll., tujuan utamanya adalah memastikan integritas RNA .

Bagaimana integritas RNA mempengaruhi keseimbangan antara gen target dan gen referensi internal dapat dengan mudah dipahami dari gambar di bawah ini.Degradasi akan menyebabkan ketidaklengkapan gen, apakah itu ketidaklengkapan gen referensi internal atau ketidaklengkapan gen target, itu akan berdampak besar pada data.

Diagram skematik gen target dan gen referensi, tidak boleh benar

Uji penghambatan (apakah nilai CT ditekan di bawah konsentrasi tinggi atau rendah atau kondisi lain)

Mengambil gambar ini sebagai contoh, nilai Ct dari lima kurva adalah sebagai berikut.Distribusi nilai CT antara kurva tidak merata, dan nilai Ct tertunda pada konsentrasi tinggi dan rendah, yang merupakan kasus penghambatan PCR.

Poin kunci: Dalam proses ekstraksi RNA, kita perlu meninggalkan kesalahpahaman dan menetapkan yang benar.

Gagasan yang salah adalah: ekstraksi RNA hanya mengejar hasil, berpikir bahwa semakin besar jumlah RNA yang diperoleh, semakin baik.Faktanya, saat kita melakukan kuantifikasi, jika jumlah gennya tidak terlalu banyak, kita tidak membutuhkan banyak RNA.Jumlah RNA yang Anda ekstrak lebih dari cukup.

Konsep yang benar adalah:Ekstraksi RNA harus mengejar kemurnian, integritas dan konsistensi.Kemurnian dapat memastikan bahwa transkripsi balik selanjutnya tidak dihambat dan data tidak akan terpengaruh oleh DNA.Integritas memastikan keseimbangan urutan target dan referensi internal.Konsistensi memastikan pemuatan sampel yang stabil.

MIQE (4) – membalikkan transkripsi
Kesalahpahaman: mengejar volume sampel yang lebih tinggi.
Konsep yang benar: Mengejar konsistensi (stabilitas), terlepas dari jumlah RNA yang dimuat, efisiensi transkripsi terbalik tetap konsisten, memastikan bahwa perbedaan dalam cDNA dapat benar-benar mencerminkan perbedaan dalam mRNA.
Kami menjelaskan proses ini dengan diagram skematik:

Diagram skema efisiensi transkripsi balik, jangan benar
Pertama-tama, kita perlu memahami perbedaan antara proses transkripsi balik dan proses PCR.PCR mengalami beberapa proses pemanasan dan anil, dan fragmen target tumbuh secara eksponensial;sementara transkripsi balik tidak memiliki proses ini, kita dapat membayangkan bahwa transkripsi balik sebenarnya satu-ke-satu Selama proses replikasi, sebanyak potongan RNA

karena ada banyak informasi cDNA yang dapat diperoleh, itu harus dipahami sekarang, karena fragmen besar dan kecil telah ditranskripsi terbalik, dan tidak mungkin untuk fokus pada satu fragmen.Dan karena jumlah RNA relatif kecil, jumlah cDNA yang diperoleh juga relatif kecil, tidak seperti PCR yang memiliki efek amplifikasi, sehingga pada dasarnya tidak mungkin untuk dideteksi.

hasil elektroforesis cDNA
Kedua, idealnya, transkripsi balik dilakukan satu-ke-satu, tetapi tidak ada transkripsi balik dari perusahaan mana pun yang dapat mencapai efek ini.Pada dasarnya, efisiensi sebagian besar reverse transcriptase berkisar antara 30-50%.Jika demikian, kami lebih suka memiliki efisiensi transkripsi balik yang relatif stabil, yang ingin kami lihat pada gambar: 3 RNA mendapatkan 2 cDNA, 6 RNA mendapatkan 4 cDNA, jadi tidak peduli berapa banyak sampel yang dimuat , efisiensi transkripsi balik relatif stabil.Kami tidak ingin melihat situasi di mana efisiensi transkripsi balik tidak stabil dan konsentrasi tinggi terhambat.

Jadi, bagaimana cara memverifikasi apakah efisiensi transkripsi balik stabil?Metodenya sangat sederhana, Anda hanya perlu melakukan tes perbandingan: satu adalah membalikkan transkrip menjadi cDNA setelah menggandakan pengenceran RNA, dan yang lainnya membuat pengenceran dua kali lipat setelah melakukan transkrip terbalik menjadi cDNA, dan kemudian melakukan qPCR untuk melihat kemiringan yang diperoleh Apakah itu konsisten.Sebagai siswa top, Anda harus memahaminya dalam hitungan detik.Seperti yang ditunjukkan di bawah ini:

Pengenceran RNA dan cDNA untuk menguji apakah efisiensi transkripsi balik stabil
Reverse transcriptase dan kit
Bagaimana PCR kuantitatif fluoresen sempurna dapat memiliki reverse transcriptase dan kit yang sangat baik.Reverse transcriptase secara kasar dibagi menjadi dua jenis menurut sumbernya, AMV atauM-MLV, dan kinerjanya sama dengan yang ditunjukkan pada tabel.

aktivitas RNase H
RNase H adalah Ribonuclease H, nama Cina adalah ribonuclease H, yang merupakan endoribonuclease yang secara khusus dapat menghidrolisis RNA dalam rantai hibrid DNA-RNA.RNase H tidak dapat menghidrolisis ikatan fosfodiester dalam DNA atau RNA beruntai tunggal atau beruntai ganda, yaitu, ia tidak dapat mencerna DNA atau RNA beruntai tunggal atau beruntai ganda.Umumnya digunakan dalam sintesis untai kedua cDNA.

Ini hal yang aneh.Kami mengatakan bahwa reverse transcriptase memiliki aktivitas RNase H, bukan reverse transcriptase yang mengandung RNase H, dan mungkin tidak mungkin untuk memisahkan RNase H dari reverse transcriptase, mungkin karena konformasi kelompok tertentu dalam reverse transcriptase Aktivitas ini disebabkan oleh reverse transcriptase.

Oleh karena itu, terlepas dari efisiensi transkripsi balik AMV yang lebih tinggi, aktivitas RNase H-nya mengurangi hasil cDNA.Tentu saja, produsen reagen terus mengoptimalkan produk mereka untuk menghilangkan aktivitas RNase H dalam transkriptase terbalik sebanyak mungkin untuk meningkatkan hasil cDNA.
Suhu anil

Struktur sekunder RNA pada temperatur yang berbeda
Lihat gambar di atas untuk struktur sekunder RNA pada suhu yang berbeda, dan gunakan alat online mFold untuk menentukan struktur sekunder fragmen target di bawah kondisi suhu dan konsentrasi garam tertentu.Pada suhu 55°C, struktur sekunder RNA masih sangat kompleks, reverse transcriptase tidak dapat bekerja, dan struktur sekunder tidak dapat diselesaikan sepenuhnya hingga 65°C, sedangkan suhu optimal AMV dan M-MLV jauh lebih rendah dari suhu ini.
apa yang harus dilakukan?Struktur sekunder adalah pasangan komplementer dari template itu sendiri, yang menyebabkan persaingan yang kuat antara primer dan reverse transcriptase dan template, menghasilkan serangkaian masalah seperti rendahnya E dan pengulangan yang buruk.

apa yang harus dilakukan?Hanya tingkatkan suhu anil sebanyak mungkin.

Banyak produsen reagen meningkatkan reverse transcriptase mereka melalui rekayasa genetika.Beberapa meningkatkan suhu reaksi, seperti Jifan dan Aidelai, dan beberapa menghilangkan gugus aktif enzim RNase H untuk meningkatkan afinitas antara enzim dan template RNA.Afinitas tinggi dapat secara kompetitif memeras struktur sekunder dan membaca dengan lancar, dan juga sangat meningkatkan efisiensi transkripsi balik.
Poin kunci: Transkripsi terbalik lebih penting untuk mengejar konsistensi efisiensi transkripsi terbalik (enzim tidak hanya harus efisien tetapi juga stabil), daripada jumlah sampel yang dimuat, jika itu bukan PCR kuantitatif fluoresen skala besar, itu tidak akan mungkin sama sekali.Beberapa cDNA.
Berbagai pabrikan juga telah melakukan beberapa upaya dalam mengejar konsistensi.Misalnya, sebagian besar perusahaan kini telah mengemas transkripsi balik sebagai kit standar untuk dijual, yang merupakan pilihan yang baik.
Misalnya, kit RT Easy Series Foregene:

RT Easy I (Master premix untuk kit sintesis cDNA untai pertama)

MIQE (5) – informasi gen target

Gambar di atas menjelaskan
1. Apakah gen ini efektif untuk eksperimen berulang umumnya dapat diverifikasi dengan eksperimen berulang.
2. ID Gen, lho.
3. Panjang gen, panjang total gen target pasti tidak ada masalah.Saat mendesain primer, pastikan panjang amplikon antara 80-200bp untuk memastikan efisiensi amplifikasi yang lebih baik.
4. Urutan Informasi perbandingan ledakan, gen target perlu dibandingkan di bank gen untuk mencegah amplifikasi non-spesifik.
5. Adanya pseudogen.Pseudogen adalah urutan DNA yang mirip dengan gen normal tetapi kehilangan fungsi normalnya.Ini sering ada dalam keluarga multi-gen eukariota.Biasanya diwakili oleh ψ.Ini adalah salinan DNA genom non-fungsional dalam genom yang sangat mirip dengan urutan gen pengkode., umumnya tidak ditranskripsi, dan tidak memiliki arti fisiologis yang jelas.
6. Posisi primer relatif terhadap ekson dan intron.Pada tahun-tahun awal, ketika kami memecahkan masalah kontaminasi DNA, kami sering memperhatikan posisi primer, ekson, dan intron, dan umumnya mempertimbangkan untuk merancang primer melintasi intron untuk menghindari amplifikasi DNA.Silakan lihat gambar di bawah ini: hitam mewakili intron, berbagai warna biru mewakili ekson, merah muda mewakili primer umum, dan merah cerah mewakili primer rentang intron.

Skema, tidak pernah benar
Tampaknya ini rencana yang sempurna, tetapi pada kenyataannya, dalam banyak kasus, primer trans-intron tidak seajaib yang dibayangkan, dan juga akan menyebabkan amplifikasi non-spesifik.Jadi cara terbaik untuk mencegah kontaminasi DNA adalah menghilangkan DNA sepenuhnya.
7. Prediksi konformasi.Dengan menggunakan contoh ini lagi, gunakan alat mFold online untuk menentukan struktur sekunder fragmen target pada suhu dan konsentrasi garam tertentu.

Struktur sekunder RNA pada temperatur yang berbeda
Struktur sekunder adalah pasangan komplementer dari template itu sendiri, yang akan menyebabkan persaingan yang kuat antara pasangan primer dan template, dan kemungkinan pengikatan primer lebih kecil, menghasilkan serangkaian masalah seperti E rendah dan pengulangan yang buruk.Melalui prediksi perangkat lunak, jika tidak ada masalah struktur sekunder, itu akan bagus.Jika ada, artikel lanjutan kami akan secara khusus membahas cara mengatasi masalah ini.

MIQE (6)—qPCR Oligonukleotida

Untuk PCR kuantitatif fluoresen, hal pertama yang Anda perjuangkan setiap hari adalah ekstraksi RNA, dan hal kedua mungkin adalah desain primer.
Pertama-tama, kami masih memeriksa aturan tentang desain primer menurut daftar periksa MIQE.Sangat sederhana sehingga bajingan bisa tertawa, dan kita bisa menyelesaikannya dalam satu kalimat: cari tahu urutan dan posisi probe primer dan metode modifikasinya.Untuk metode pemurnian primer, sintesis primer sangat murah saat ini, qPCR layak untuk metode pemurnian PAGE dan di atas, dan informasi instrumen sintesis tidak penting.Banyak orang telah melakukan primer selama beberapa dekade dan tidak tahu bahwa penyintesisnya adalah ABI3900.
Mengenai prinsip-prinsip desain primer, Anda tidak perlu menghafalnya di luar kepala, karena sebagian besar perangkat lunak desain primer atau alat online dapat mengatasi masalah ini (disarankan alat online primer3.ut.ee/), dan 99,999% desain primer tidak dilakukan secara manual.
Cukup periksa poin-poin berikut setelah primer dirancang:
1. Desain primer yang dekat dengan ujung 3′: Dalam kasus penggunaan primer oligo dT untuk sintesis untai pertama cDNA, dengan mempertimbangkan efisiensi transkripsi balik dan integritas RNA, primer yang dirancang perlu dirancang dekat dengan ujung 3′ untuk meningkatkan efisiensi amplifikasi .Gunakan gambar untuk menjelaskan sebagai berikut (tidak ada cara untuk memahami ini):

Mengapa primer dirancang dekat dengan ujung 3′, itu pasti tidak benar
2. Nilai TM: Nilai Tm pada 55-65°C (karena aktivitas eksonuklease paling tinggi pada 60°C), dan kandungan GC pada 40%-60%.
3. BLAST: Untuk menghindari amplifikasi genom non-spesifik, ledakan harus digunakan untuk verifikasi tambahan.

MIQE(7)—proses qPCR

1. kit qPCR
Sesuai persyaratan MIQE, kita harus dengan jelas menggambarkan kondisi reaksi lengkap dalam artikel, termasuk konfigurasi sistem reaksi PCR, kit apa yang digunakan, siapa pabrikannya, seberapa besar sistem reaksinya, apakah metode pewarna atau metode probe yang digunakan, pengaturan program PCR.Pengemudi veteran pasti akan menemukan bahwa selama kit dipilih, informasi di atas pada dasarnya ditentukan.
Saat ini, pembuatan dan produksi kit PCR kuantitatif fluoresen adalah teknologi yang sangat matang.Selama Anda tidak memilih pabrikan yang sangat buruk, kemungkinan masalah tidak tinggi, tetapi kami tetap ingin berbagi beberapa poin dengan Anda:
Enzim Taq mulai panas:Bagian terpenting dari PCR adalah enzim Taq hot-start.Enzim hot-start di pasaran umumnya dibagi menjadi dua jenis, satu adalah enzim hot-start yang dimodifikasi secara kimiawi (Anda dapat membayangkannya sebagai penyematan parafin), dan yang lainnya adalah enzim hot-start untuk modifikasi antibodi (pengikatan antigen-antibodi).Modifikasi kimia adalah cara awal enzim hot-starting.Ketika suhu tertentu tercapai, enzim akan melepaskan aktivitasnya.Enzim hot-start yang dimodifikasi antibodi menggunakan metode biologis untuk memblokir aktivitas enzim.Ketika suhu tertentu tercapai, antibodi akan didenaturasi dan dinonaktifkan sebagai protein, dan aktivitas enzim akan berperan.

Namun, apa gunanya ini?Dalam hal ini, aktivitas pelepasan enzim yang dimodifikasi antibodi lebih cepat daripada enzim yang dimodifikasi secara kimiawi, sehingga dalam hal sensitivitas, enzim yang dimodifikasi antibodi memiliki sedikit keuntungan, sehingga pada dasarnya tidak ada enzim yang dimodifikasi secara kimiawi dalam kit di pasaran.Jika ada, maka teknologi pabrikan ini masih mentok di era milenium.
Konsentrasi ion magnesium:Konsentrasi ion magnesium sangat penting dalam reaksi PCR.Konsentrasi ion magnesium yang tepat dapat mendorong pelepasan aktivitas enzim Taq.Jika konsentrasinya terlalu rendah, aktivitas enzim akan berkurang secara signifikan;jika konsentrasinya terlalu tinggi, amplifikasi non-spesifik yang dikatalisis oleh enzim akan ditingkatkan.Konsentrasi ion magnesium juga akan mempengaruhi anil primer, suhu leleh template dan produk PCR, sehingga mempengaruhi hasil fragmen yang diamplifikasi.Konsentrasi ion magnesium umumnya dikontrol pada 25mM.Tentunya untuk kit yang baik, konsentrasi ion magnesium harus terkontrol dengan baik.Beberapa pedagang menambahkan zat pengkelat ion magnesium ke reagen, yang dapat mencapai efek penyesuaian otomatis konsentrasi ion magnesium.
Konsentrasi pewarna neon:Pewarna fluoresen, yang merupakan SYBR Green yang biasa kita gunakan, terutama menghasilkan fluoresensi dengan mengikat alur minor DNA beruntai ganda, karena pengikatan pewarna ke DNA beruntai ganda tidak spesifik, artinya Selama DNA beruntai ganda digabungkan dengannya, fluoresensi dapat terjadi, sehingga dimer primer dan templat DNA dalam sistem akan bergabung dengannya untuk membentuk sinyal latar.
PS: Karena sifatnya yang peka terhadap cahaya, produk di pasaran umumnya dikemas dalam tabung centrifuge buram berwarna coklat (seperti terlihat pada gambar di bawah).Namun, hal ini akan menemui masalah.Sulit untuk melihat apakah cairan tersedot saat pengambilan sampel.Dalam hal ini, Qingke memang yang paling ramah pengguna (seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah), dan tabung transparan dikemas dalam kantong timah buram.Kemudian masukkan ke dalam kantong timah, dengan mempertimbangkan kenyamanan menghindari cahaya dan pengambilan sampel.Anda harus memilih nomor produk yang tepat.TSE204 adalah keberadaan yang sangat hemat biaya, yang membuat saya ingin menanam rumput.

Konsentrasi pewarna fluoresen juga sangat penting.Jika konsentrasinya terlalu rendah, kurva amplifikasi tidak akan naik pada tahap selanjutnya dan tidak sempurna;jika konsentrasi terlalu tinggi, akan menimbulkan gangguan kebisingan.Karena PCR kuantitatif fluoresen terutama bergantung pada nilai CT, jika konsentrasi pewarna fluoresen tidak disesuaikan dengan benar, titik rendah lebih baik daripada titik tinggi.Tentu saja, konsentrasi pewarna yang tepat adalah yang terbaik.

ROX: Pewarna ROX digunakan untuk mengoreksi kesalahan sinyal fluoresensi baik-ke-baik.Beberapa produsen instrumen memerlukan kalibrasi, sementara yang lainnya tidak.Misalnya, penggunaan instrumen amplifikasi PCR Waktu Nyata Thermo Fisher Scientific biasanya memerlukan kalibrasi, termasuk 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, dll. Instruksi kit umum akan menjelaskannya.
qPCR Mix Foregene juga mengandung pewarna ROX, yang nyaman untuk digunakan dalam berbagai model.

Kit-Taqman PCR Waktu Nyata

Perlakuan ikatan hidrogen lemah: Perawatan ikatan hidrogen yang lemah adalah masalah yang relatif teknis.Tidak ada yang membaca manual dari banyak kit, tetapi tidak satupun dari mereka menyebutkan topik ini.Faktanya, ini sangat penting.Kombinasi basa terutama bergantung pada kekuatan ikatan hidrogen.Ikatan hidrogen yang kuat adalah amplifikasi normal, dan ikatan hidrogen yang lemah menyebabkan amplifikasi nonspesifik.Jika ikatan hidrogen yang lemah tidak dapat dihilangkan dengan baik, amplifikasi non-spesifik tidak dapat dihindari.Dalam lingkup penulis, hanya beberapa perusahaan yang memperhatikan masalah ini.Saat Anda membeli kit, Anda dapat merujuk pada apakah Anda telah mempertimbangkan solusi terkait kit yang ingin Anda pilih.

volume reaksi: Sistem 20-50ul lebih umum digunakan, dan volume yang lebih kecil cenderung menyebabkan kesalahan.Secara umum, instruksi kit akan merekomendasikan penggunaan volume reaksi PCR.Jangan pintar dan gunakan volume yang lebih kecil untuk menghemat biaya.tujuan dari.Volume yang direkomendasikan oleh pedagang sebenarnya telah diuji, dan mungkin mereka tidak dapat menyelesaikan masalah kesalahan yang disebabkan oleh volume kecil.
2. Pabrikan dan nomor artikel pelat tabung
Semua orang tahu prinsip PCR kuantitatif fluoresen.Pengumpulan fluoresensi terutama dilakukan melalui tutup tabung PCR.Saat memilih bahan habis pakai PCR, perhatikan dua hal: transmisi cahaya yang baik dan cocok untuk instrumen.Secara umum, papan dan tabung merek arus utama baik-baik saja, tetapi Anda harus memilih dengan hati-hati dalam hal adaptasi, jika tidak, Anda tidak akan dapat menggunakan instrumen tersebut.

4. Pengetahuan tingkat atas

MIQE (8)—validasi qPCR
Ini adalah prioritas utama qPCR!Begitu banyak pahlawan yang jatuh ke pasir di sini.Tentu saja, mungkin juga Anda beruntung dan gen yang Anda pelajari sederhana, jadi Anda melayang melalui gua es mengikuti angin.Informasi verifikasi qPCR dimaksudkan untuk menguji keandalan data.Kami mencantumkan informasi verifikasi yang diperlukan sebagai berikut:

1. Tes spesifisitas
Spesifisitas amplifikasi gen target diuji dengan memeriksa apakah gambar elektroforesis berupa pita tunggal;verifikasi pengurutan;kurva leleh untuk melihat apakah peta puncaknya tunggal;verifikasi pencernaan enzim dan metode lainnya.
Di sini, kami fokus pada tAnalisis amplifikasi non spesifik menggunakan metode melting curves.Secara umum, ketika kami mendesain primer, ukuran fragmen produk harus berada di kisaran 80-200bp, yang membuat suhu leleh produk PCR berkisar antara 80-85 °C.Oleh karena itu, jika ada bermacam-macam puncak, harus ada produk amplifikasi non-spesifik lainnya;jika puncak muncul di bawah 80°C, umumnya dianggap sebagai dimer primer;jika puncak muncul di atas 85°C, umumnya dianggap sebagai kontaminasi DNA atau amplifikasi nonspesifik dari fragmen besar.
Catatan: Terkadang hanya ada satu puncak pada suhu 80°C.Saat ini, konsep ini harus dipatuhi.Kemungkinan hasil amplifikasi semuanya dimer primer.

Kurva leleh normal (puncak tunggal tanpa amplifikasi non-spesifik)

Kurva peleburan yang bermasalah (amplifikasi non-spesifik dari puncak palsu)
【Analisis kasus】

Ada puncak utama, tetapi dimer primernya serius
Kurva leleh puncak tunggal pada gambar di bawah ini dapat dengan mudah menipu mata Anda, menganggapnya sebagai eksperimen yang sempurna, tetapi hasilnya sama sekali salah.Saat ini, kita harus melihat suhu leleh.Suhu puncak di bawah 80°C, yang sepenuhnya dimer primer.

Tidak ada fragmen target, semua dimer primer
Di sini, saudaraku tidak bisa berhenti.Gambar di bawah ini adalah foto yang diambil dengan ponsel yang dikirimkan kepada saya oleh seorang bajingan.Reagen yang dia gunakan adalah semua merek yang umum digunakan di industri.Dia mengubah dari satu merek awalan T ke merek awalan T lainnya.Saya pikir Anda sudah menebaknya.Bajingan itu berteriak kepada saya: “Reagen yang digunakan pada gambar pertama terlalu bagus, dan puncaknya tunggal.Nanti setelah menggunakan reagen yang anda rekomendasikan menjadi seperti gambar kedua, dengan campuran puncak.Anda telah membuat saya sengsara.“
Pisahkan kedua grafik.Sekilas, yang satu memiliki puncak tunggal, dan yang lainnya memiliki puncak ganda.Omong kosong, satu puncak tentu saja baik-baik saja.Benarkah itu?
Lebih buruk dari Dou E, jika saya menempatkan dua gambar pada gambar di bawah ini, Anda akan langsung mengerti.Nyatanya, kita mudah dilumpuhkan oleh gambaran seperti ini.Setelah analisis yang cermat, kami menemukan bahwa: puncak angka pertama adalah pada 75°C, yang merupakan dimer primer sepenuhnya;puncak angka kedua muncul pada 75°C dan 82°C, setidaknya ada produk yang muncul.

Gambar umpan balik dari siswa
Jadi masalah mendasarnya bukan masalah reagen, tapi masalah desain primer.Sekaligus membuktikan bahwa beberapa merek besar tidak berkualitas besi, dan juga membuktikan apa yang dikatakan saudara saya sebelumnya: Bukan merek reagen yang mendukung artikel Anda.Artikel Andalah yang menopang merek reagen.Bayangkan saja, jika bajingan itu tidak mengganti reagennya, data yang salah akan dikirim ke jurnal, dan yang terjadi akan menjadi tragedi.
2. Nilai Ct kontrol kosong
Jangan dijelaskan, jika kontrol kosong memiliki nilai Ct, apakah itu polusi?Namun, Anda tetap perlu memahami kontrol kosong mana yang memiliki nilai Ct.Kalau NTC berarti ada DNA asing seperti kontaminasi reagen.Jika itu NRT, berarti RNA yang diekstraksi memiliki kontaminasi DNA.
3. Kurva standar
Termasuk rumus kemiringan dan perhitungan, efisiensi PCR dapat dihitung melalui rumus tersebut.Eksperimen yang sempurna membutuhkan kemiringan kurva standar mendekati 3,32, dan R² mendekati 0,9999.
4. Rentang dinamis linier
Kisaran dinamis dari reaksi adalah linier.Menurut template yang digunakan untuk menghasilkan kurva standar, rentang dinamis harus mencakup setidaknya 5 gradien konsentrasi, dan memperhatikan perubahan nilai Ct pada gradien konsentrasi tinggi dan gradien konsentrasi rendah.
5. Akurasi deteksi
Perubahan hasil qPCR, yaitu pengulangan yang buruk, yaitu presisi yang buruk, disebabkan oleh banyak faktor, termasuk suhu, konsentrasi, dan operasi.Presisi qPCR umumnya menjadi kurang dapat dikontrol karena jumlah salinan berkurang.Idealnya dalam variasi eksperimental, variasi teknis ini harus berbeda dari variasi biologis, dan ulangan biologis dapat secara langsung mengatasi perbedaan statistik dalam hasil qPCR antara kelompok atau perlakuan.Khususnya untuk asai diagnostik, presisi antar-assay terbaik (repeatability) di seluruh lokasi dan operator harus dilaporkan.
6. Efisiensi pendeteksian dan LOD (dalam multiplex qPCR)
LOD adalah konsentrasi terendah dari 95% sampel positif yang terdeteksi.Dengan kata lain, konsentrasi LOD yang terkandung dalam satu set replikasi gen target tidak boleh melebihi 5% dari reaksi yang gagal.Ketika melakukan analisis qPCR multipleks, terutama untuk deteksi mutasi titik atau polimorfisme secara simultan, qPCR multipleks perlu memberikan bukti bahwa keakuratan beberapa fragmen target tidak terganggu dalam tabung yang sama, deteksi ganda dan efisiensi deteksi tabung tunggal dan LOD harus sama.Terutama ketika gen target konsentrasi tinggi dan gen target konsentrasi rendah diamplifikasi secara bersamaan, masalah ini harus diperhatikan.
Masalah dan solusiSecara umum, masalah yang sering dihadapi dalam debugging qPCR fokus pada aspek-aspek berikut:
· amplifikasi nonspesifik
· Pilihan konsentrasi primer yang sulit dan masalah dengan dimer primer
· Suhu anil tidak akurat
· Struktur sekunder mempengaruhi efisiensi amplifikasi
amplifikasi nonspesifik
amplifikasi nonspesifikterjadi , umumnya dipertimbangkan apakah desain primer tidak cocok, tetapi jika Anda tidak terburu-buru untuk mengganti primer, Anda dapat mencoba metode berikut terlebih dahulu (prinsipnya juga terlampir):
·Meningkatkan suhu anil – mencoba membuat ikatan hidrogen yang lemah tidak dapat dipertahankan;
· Mempersingkat waktu anil dan pemanjangan – mengurangi kemungkinan lemahnya ikatan hidrogen;
·Mengurangi konsentrasi primer – mengurangi kemungkinan pengikatan primer berlebihan dan daerah non-target;
Efisiensi amplifikasi rendah
Situasi yang berlawanan dengan amplifikasi non-spesifik – efisiensi amplifikasi rendah, dan langkah-langkah untuk mengatasi efisiensi amplifikasi rendah justru sebaliknya:
· Memperpanjang waktu anil dan elongasi;
· Ubah ke PCR tiga langkah dan kurangi suhu anil;
· Meningkatkan konsentrasi primer;
Ps: Banyak mahasiswa pascasarjana yang lahir di tahun 90-an tidak mau mempelajari cara men-debug percobaan, dan berharap kit tersebut dapat menyelesaikan masalah sepenuhnya (jika Anda ingin pergi ke perusahaan reagen untuk melakukan penelitian dan pengembangan setelah lulus), pada kenyataannya, produsen reagen juga berpikir seperti ini, saya harap ini bodoh Ini dapat digunakan ketika Anda mendapatkannya, jadi produsen reagen telah menghabiskan banyak upaya untuk menyelesaikan masalah amplifikasi non-spesifik, termasuk pengenalan faktor penyerapan ikatan-H yang lemah.Untuk menyelesaikan masalah dengan mudah, orang bodoh masih harus membaca pengenalan perusahaan reagen untuk melihat apakah ada faktor yang menyerap ikatan hidrogen yang lemah.
Pilihan konsentrasi primer yang sulit dan masalah dengan dimer primer
Metode 1: Secara umum, instruksi kit untuk qPCR telah merekomendasikan sistem dan merekomendasikan konsentrasi primer.
Metode 2: Debugging dengan mengatur gradien konsentrasi primer.Gambar di bawah ini dicuri dari sebuah perusahaan sebagai ilustrasi.Gambar di bawah menunjukkan hasil kuantitatif fluoresensi yang dibuat dengan tiga gradien konsentrasi primer (100nM, 250nM, 500nM) dan empat gradien konsentrasi templat (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Nilai Ct hasil eksperimen diplot sebagai berikut:

Pemilihan Konsentrasi Primer Gabungkan setiap konsentrasi primer menjadi satu baris sebagai berikut:

Pilihan konsentrasi primer jelas, hubungan linier konsentrasi primer 100nM dan 250nM lebih baik, dan hubungan linier konsentrasi primer 500nM relatif buruk.Pada 100nM dan 250nM, nilai Ct 250nM relatif kecil, sehingga konsentrasi primer yang optimal adalah 250nM.Umumnya dimer primer yang parah dapat dilihat pada kurva leleh.Bagaimana jika primer yang dirancang tidak dapat menghindari primer-dimer?
Metode 3: Kurangi jumlah primer dan tingkatkan suhu anil (tidak perlu dijelaskan).
Nilai empiris suhu annealing adalah 60°C.Jika Anda tidak yakin, bagaimana cara memilih suhu anil yang lebih sesuai?Jawabannya sama dengan pemilihan konsentrasi primer –uji gradien.Ambil gambar dari perusahaan Bio-rad untuk mengilustrasikan masalahnya.Untuk amplifikasi fragmen target tertentu, atur delapan gradien suhu, masing-masing dengan tiga pengulangan, dan kurva amplifikasi yang diperoleh adalah sebagai berikut:

pemilihan suhu anil:
·70°C, 69°C—Pada dasarnya, primer tidak dapat digabungkan, jadi tidak ada amplifikasi.
·67,3°C – Ada sedikit amplifikasi di awal, dan nilai Ct relatif besar.
·64,5°C——Nilai Ct menurun.
·Pada suhu 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C, dan 55,0°C, nilai Ct pada dasarnya cenderung stabil, tetapi nilai fluoresensi akhir berbeda.
Bagaimana cara memilih?Prinsip: Prinsip pertama adalah nilai Ct yang lebih tinggi.Untuk nilai Ct yang sama, pilih suhu anil yang lebih tinggi untuk menghindari dimerisasi dan amplifikasi non-spesifik.Meskipun ada nilai fluoresensi yang lebih tinggi pada 55°C, mungkin ada dimer atau amplifikasi non-spesifik di dalamnya.
Tetapi jika Anda secerdas Anda, Anda pasti akan berpikir: Logikanya, jika reaksi PCR sangat spesifik, selama konsentrasi primer melebihi persyaratan minimum, titik tinggi dan rendah tidak akan berpengaruh, seperti halnya pewarna fluoresen dan dNTP.Memang, selama suhu anil dioptimalkan dengan baik, efek konsentrasi primer pada nilai Ct secara alami akan diminimalkan.

Suhu anil dioptimalkan dengan baik, dan efek konsentrasi primer pada CT akan diminimalkan
Struktur sekunder mempengaruhi efisiensi amplifikasi
Mari ambil gambar dari Bio-rad untuk mengilustrasikan masalahnya.Ini juga merancang gradien suhu untuk memperkuat gen dengan struktur sekunder.

Struktur sekunder muncul
Dapat dilihat bahwa ketika gradien suhu menurun, produk mulai muncul dan nilai Ct bergerak maju, mencapai nilai minimum pada 60,7°C, dan kemudian ketika gradien suhu menurun, nilai Ct menjadi lebih besar.Sebaliknya, ketika suhu meningkat, struktur sekunder terbuka dan efisiensi amplifikasi meningkat.Setelah mencapai suhu tertentu, menaikkan suhu tidak dapat meningkatkan efisiensi amplifikasi.Karena primer tidak dapat digabungkan secara stabil saat ini.Karena itu,cari suhu dengan nilai Ct terendah, yang merupakan suhu terbaik untuk memperkuat templat struktur sekunder!Tentu saja, orang bodoh yang pintar harus tahu bahwa jika tidak perlu, yang terbaik adalah mengganti primer dan menghindari area struktur sekunder.
5. Tingkat aplikasi
MIQE—Analisis Data

Analisis data terutama diberikan oleh instrumen PCR kuantitatif fluoresen.Pada artikel sebelumnya, banyak pekerjaan analisis data telah dilakukan, seperti kontrol kosong, yang telah dijelaskan dalam desain percobaan.Gen referensi internal, angka berulang, dll. Telah diklarifikasi., di sini kami terutama menjelaskan penerapan qPCR.
qPCR digunakan secara luas, dan verifikasi eksperimental serta diagnosis asam nukleat adalah skenario yang paling umum digunakan.
kuantifikasi absolut
Log (konsentrasi awal) memiliki hubungan linier dengan jumlah siklus.Kurva standar dapat ditarik dari standar dengan nomor salinan awal yang diketahui, yaitu, hubungan linier dari reaksi amplifikasi dapat diperoleh.Menurut nilai Ct sampel, konsentrasi dalam sampel dapat dihitung.Jumlah template yang akan disertakan.

Metode Perhitungan Kuantitatif Mutlak
Kuantifikasi absolut harus didasarkan pada kurva standar.Untuk membuat kurva standar, diperlukan standar.Biasanya, standarnya adalah plasmid yang diperoleh dengan mengkloning gen target.Mengapa itu plasmid?Karena DNA plasmid sirkular adalah yang paling stabil.Encerkan produk standar dalam 5 hingga 6 gradien sesuai dengan rasio penggandaan (pengenceran 10 kali lipat), dan perhatikan keseragaman saat mengencerkan.Biarkan nilai Ct turun antara 15-30.

Persiapan standar
Pada saat yang sama, sampel yang akan diuji juga harus diencerkan (ingat faktor pengenceran), dan nilai Ct juga harus turun antara 15-30.Produk standar + sampel yang akan diuji diletakkan di mesin bersama.Setelah run, dibuat kurva standar dengan bahan standar, dan sampel yang akan diuji dibawa ke kurva standar untuk dihitung konsentrasinya.
Kuantifikasi virus hepatitis B HBV adalah kuantifikasi absolut tipikal, yang dapat menghitung jumlah salinan virus dalam 1 ml darah.
Perhitungan nomor salinan
Konsentrasi sampel yang akan diuji (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × faktor pengenceran
Berat molekul sampel = jumlah basa × 324
Nomor salinan sampel yang akan diuji (salinan/ul) = konsentrasi sampel yang akan diuji / berat molekul sampel × 6 × 1014

Metode perhitungan nomor salinan

Di atas adalah metode perhitungan untuk menentukan kuantitas.Ini adalah soal matematika yang bisa diselesaikan setelah lulus SMP, dan soal matematika umumnya diselesaikan dengan komputer.Jika Anda tidak mengerti, Anda bisa datang untuk berkomunikasi.
kuantifikasi relatif
Kuantifikasi relatif terutama digunakan dalam penelitian ilmiah.Berapa banyak virus yang ada dalam 1ml darah, dan itu adalah virus DNA, ini adalah peristiwa yang relatif deterministik: jumlah darah dapat ditentukan, dan virus DNA relatif stabil.Namun, sulit bagi kami untuk membandingkan jumlah salinan transkripsi gen tertentu dalam daun, karena sulit untuk menentukan ukuran, berat, dan kelembutan daun, jumlah RNA yang diekstraksi sulit untuk ditentukan, dan efisiensi transkripsi balik juga sulit untuk ditentukan , artinya, langkah apa pun dapat membuat data eksperimen memiliki bug dan tidak dapat digunakan.
Oleh karena itu, kuantifikasi relatif harus memperkenalkan elemen:gen referensi internal.
Dengan kata lain, kuantifikasi relatif sebenarnya adalah perbandingan antara gen target dan gen referensi internal.Dibandingkan dengan jaringan yang sama dan sel yang sama, pengaruh ukuran sampel, jumlah ekstraksi RNA, efisiensi transkripsi terbalik, dan efisiensi PCR relatif kecil.Karena ukuran sampel yang kecil, gen referensi internal dan gen target relatif berkurang.Inilah mengapa kami telah menekankan keseragaman dan stabilitas sebelumnya.
Gen referensi internal umumnyagen rumah tangga(gen pemelihara rumah), yang merujuk pada kelas gen yang diekspresikan secara stabil di semua sel, dan produknya diperlukan untuk mempertahankan aktivitas kehidupan dasar sel.
Jangan bingung dengan konsep ini.Gen rumah tangga adalah istilah fungsi biologis, sedangkan gen referensi internal adalah istilah teknis eksperimental.Gen housekeeping harus lulus validasi sebelum dapat dipilih sebagai gen referensi internal.
Sebagai contoh, kami memilih beberapa gen rumah tangga pada gambar di bawah untuk menguji tingkat ekspresinya dalam sel jaringan yang berbeda, dan menemukan bahwa tingkat ekspresi β-2-mikroglobulin sangat berbeda dari tiga gen lainnya, sehingga tidak dapat digunakan sebagai gen referensi internal.

Setelah memahami fungsi koreksi gen referensi internal, dua algoritma diturunkan karena pengenalan gen referensi internal.
· metode kurva standar ganda
·2 – △△Metode Ct (metode perbandingan nilai CT)
Jika Anda tertarik untuk mempelajari spesies dan fungsi gen, harap hentikan penelitian tentang algoritme dan gunakan rumus secara langsung, atau gunakan mesin secara langsung;jika Anda adalah orang yang lurus dalam matematika dan teknik, silakan.
metode kurva standar ganda
Kuantifikasi gen target dan gen housekeeping dari sampel kontrol dan sampel yang akan diuji melalui kurva standar, lalu hitung nilai relatif sesuai dengan rumus perhitungan, yaitu tingkat ekspresi relatif.
Keuntungan: analisis sederhana, optimasi eksperimental yang relatif sederhana
Kerugian: Untuk setiap gen, setiap putaran eksperimen harus membuat kurva standar
Aplikasi: Salah satu dari dua metode kuantitatif relatif yang paling umum digunakan dan diakui dalam studi regulasi ekspresi gen
Rumusnya adalah sebagai berikut:

Contohnya adalah sebagai berikut:

Hitung jumlah relatif berdasarkan hasil kuantitatif
2 – △△Metode Ct (metode perbandingan nilai CT)

Keuntungan: Tidak perlu membuat kurva standar
Kekurangan: Diasumsikan bahwa efisiensi amplifikasi mendekati 100%;standar deviasi adalah <5%, dan kurva standar serta efisiensi antara masing-masing amplifikasi diasumsikan konsisten;optimalisasi kondisi eksperimental lebih rumit.
Aplikasi: Salah satu dari dua metode kuantitatif relatif yang paling umum digunakan dan diakui dalam studi regulasi ekspresi gen

Tentu saja efisiensi amplifikasi biasanya tidak mungkin sempurna. －△△Ct
Sejauh ini, konten tentang PCR kuantitatif fluoresen telah berakhir.