Escherichia Coli O157: Kit Deteksi Asam Nukleat H7 (Metode Probe Fluorescent PCR/Liofilisasi)
Keterangan Kit:
Kucing.No.FP103
Ini digunakan untuk deteksi cepat dan penyaringan E. coli O157:H7 dalam makanan, pakan, sampel air, dan sampel lingkungan.
Deskripsi
Ini digunakan untukdeteksi cepat dan penyaringan E. coli O157:H7 dalam sampel makanan, pakan, air, dan sampel lingkungan.
[Prinsip pengujian]
Sesuai dengan prinsip teknologi fluoresen PCR, primer spesifik dan probe Taqman dirancang untuk gen spesifik Escherichia coli O157: H7, dan dideteksi oleh instrumen PCR fluoresen, untuk mewujudkan deteksi Escherichia coli O157: H7 Deteksi kualitatif DNA.
Isi Paket
Catatan: Probe saluran ROX tidak disertakan.
| Ckomponen | Spesifikasi | Qkuantitas |
| Penyangga A | Tabung | 1 |
| Penyangga B | Tabung | 1 |
| Kontrol positif | Tabung | 1 |
| Kontrol negatif | Tabung | 1 |
Penggunaan yang Diharapkan
Ini digunakan untuk deteksi cepat dan penyaringan E. coli O157:H7 dalam sampel makanan, pakan, air, dan sampel lingkungan.
Kondisi Penyimpanan Dan Tanggal Kedaluwarsa
Simpan pada -20 ℃ dalam gelap dan hindari pembekuan dan pencairan berulang.
Masa berlakunya adalah 12bulan, dan tanggal produksi tertera pada kemasan luar.
Instrumen Dan Bahan Habis Pakai
Instrumen PCR kuantitatif berpendar, pistol pipet dan tip yang cocok, pengocok pusaran, sentrifugal mini.
Penggunaan
1. Pemrosesan Sampel
1.1 Jenis sampel: Kit ini cocok untuk sampel makanan, pakan, air, dan sampel lain yang diduga terkontaminasi oleh Escherichia coli O157:H7.Untuk produk daging olahan, minuman, dan zat lain yang mengandung pigmen, perlu dibilas agar tidak memengaruhi pengumpulan sinyal fluoresensi.
1.2 Pemrosesan sampel: Lihat "GB 4789.10-2016 Standar Nasional Keamanan Pangan Pemeriksaan Mikrobiologi Pangan Escherichia coli O157: Uji H7" untuk persiapan sampel, kultur pengayaan dan isolasi Escherichia coli O157: H7.
- Nekstraksi asam ukleat
Ambil 20 mL larutan pengayaan dalam tabung sentrifus 1,5 mL, tambahkan 200 µL lisat mikroba (kit tambahan diperlukan), vorteks selama 30 detik, sentrifus sebentar, dan sisihkan.
Catatan: Ekstraksi asam nukleat dari lisat harus diselesaikan dalam waktu 10 menit, dan tidak dapat disimpan dalam waktu lama.
3. Amplifikasi Asam Nukleat
3.1 Nyalakan instrumen PCR kuantitatif berpendar untuk digunakan.
Buffer A dan Buffer B dari kit, lelehkan seluruhnya, dan centrifuge sebentar.Tambahkan 18 μL Buffer A dan 2 μL Buffer B ke masing-masing tabung reaksi PCR.Kemudian tambahkan masing-masing 5 mL kontrol negatif, ekstrak asam nukleat, dan kontrol positif ke dalam tabung reaksi PCR, tutup tabung, dan sentrifus sebentar.
3.3 Pindahkan tabung reaksi PCR ke mesin PCR berpendar, dan gunakan prosedur berikut untuk melakukan eksperimen amplifikasi: pilih 25 mL untuk sistem reaksi, kumpulkan sinyal fluoresensi pada 60°C untuk setiap siklus, dan pilih FAM untuk saluran deteksi.
| Melangkah | Program | Jumlah siklus |
| 1 | 37 ℃ 5 menit | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 menit | 1 |
| 3 | 95°C 15 detik | 4 0 |
| 60℃ 30s (mengumpulkan fluoresensi) |
Panduan untuk analisis masalah
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Tidak ada RNA yang dapat diekstraksi atau hasil asam nukleat rendah
Biasanya ada banyak faktor yang mempengaruhi efisiensi pemulihan, seperti: konten RNA sampel, metode operasi, volume elusi, dll.。
Analisis penyebab umum：
1.Penangas es atau sentrifugasi suhu rendah (4 ° C) selama pengoperasian.
Saran: Suhu kamar (15-25 ° C) operasi, tidak pernah mandi es dan centrifuge suhu rendah.
2. Penyimpanan sampel yang tidak tepat atau penyimpanan sampel yang terlalu lama.
Saran: Simpan sampel pada suhu -80 °C atau bekukan dalam nitrogen cair, dan hindari penggunaan freeze-thaw berulang;coba gunakan sampel yang baru dikumpulkan untuk ekstraksi RNA.
3. Sampel lisis tidak mencukupi
Rekomendasi: Harap pastikan bahwa sampel dan larutan kerja (Linear Acrylamide) telah tercampur rata dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar (15-25 ° C)
4.Eluen ditambahkan secara tidak benar
Rekomendasi: Pastikan ddH2O Bebas RNase ditambahkan ke tengah membran kolom pemurnian
5. Volume etanol anhidrat yang tidak tepat dalam Buffer viRW2
Saran: Silakan ikuti petunjuknya, tambahkan volume etanol anhidrat yang benar ke Buffer viRW2 dan campur dengan baik sebelum menggunakan kit。
6. Penggunaan sampel yang tidak tepat.
Saran: 200μl sampel per 500μl Buffer viRL.Volume sampel yang berlebihan akan menghasilkan tingkat ekstraksi RNA yang berkurang.
7. Volume elusi tidak tepat atau elusi tidak lengkap.
Saran: Volume eluen kolom pemurnian adalah 30-50μl;jika efek elusi tidak memuaskan, disarankan untuk menambahkan ddH Bebas RNase yang telah dipanaskan sebelumnya2O dan perpanjang waktu dengan menempatkan pada suhu kamar, seperti 5-10 menit
8.Kolom pemurnian memiliki residu etanol setelah dibilas dalam Buffer viRW2.
Saran: Jika etanol masih tersisa setelah pembilasan dalam Buffer viRW2 dan sentrifugasi tabung kosong selama 2 menit, kolom pemurnian dapat dibiarkan pada suhu kamar selama 5 menit setelah sentrifugasi tabung kosong untuk sepenuhnya menghilangkan sisa etanol.
Degradasi molekul RNA murni
Kualitas RNA yang dimurnikan terkait dengan faktor-faktor seperti penyimpanan sampel, kontaminasi RNase, dan pengoperasian.
Analisis penyebab umum：
1. Sampel yang dikumpulkan tidak disimpan tepat waktu.
Saran: Jika sampel tidak digunakan tepat waktu setelah pengumpulan, harap segera simpan pada suhu -80 ℃ atau nitrogen cair.Untuk ekstraksi molekul RNA, coba gunakan sampel yang baru dikumpulkan jika memungkinkan.
2. Sampel yang dikumpulkan dibekukan dan dicairkan berulang kali.
Saran: Hindari pembekuan dan pencairan berulang (tidak lebih dari satu kali) selama pengumpulan dan penyimpanan sampel, jika tidak maka rendemen asam nukleat akan menurun.
3.RNase diperkenalkan di ruang operasi atau tidak ada sarung tangan sekali pakai, masker, dll.
Saran: Percobaan ekstraksi molekul RNA sebaiknya dilakukan di ruang operasi RNA yang terpisah, dan meja percobaan dibersihkan sebelum percobaan.Kenakan sarung tangan dan masker sekali pakai selama percobaan untuk menghindari degradasi RNA yang disebabkan oleh pengenalan RNase.
4. Reagen terkontaminasi oleh RNase selama penggunaan.
Saran: Ganti dengan Viral RNA Isolation Kit baru untuk eksperimen terkait.
5. Kontaminasi RNase pada tabung sentrifus, ujung pipet, dll. Saran: Pastikan tabung sentrifus, ujung pipet, dan ujung pipet semuanya Bebas RNase.
Molekul RNA yang dimurnikan memengaruhi eksperimen hilir
Molekul RNA yang dimurnikan oleh kolom pemurnian akan memengaruhi eksperimen hilir jika terlalu banyak ion garam atau protein, seperti: transkripsi terbalik, Noda Utara, dll.。
1.Ada sisa ion garam dalam molekul RNA yang dielusi.
Rekomendasi: Pastikan volume yang tepat dari etanol anhidrat telah ditambahkan ke Buffer viRW2, dan cuci kolom pemurnian dua kali sesuai dengan kecepatan sentrifugasi yang benar pada instruksi pengoperasian;Jika masih ada ion garam yang tersisa, Anda dapat menambahkan Buffer viRW2 ke kolom pemurnian, dan biarkan pada suhu kamar selama 5 menit.Kemudian lakukan sentrifugasi untuk menghilangkan kontaminasi ion garam secara maksimal
2. Ada sisa etanol dalam molekul RNA yang dielusi
Saran: setelah memastikan bahwa kolom pemurnian telah dibilas dengan Buffer viRW2, lakukan sentrifugasi tabung kosong sesuai dengan kecepatan sentrifugal pada instruksi pengoperasian.Jika masih ada etanol yang tersisa, dapat dibiarkan selama 5 menit pada suhu kamar setelah sentrifugasi tabung kosong untuk menghilangkan sisa etanol secara maksimal.
Instruksi Manual:
Manual Instruksi Kit Isolasi RNA Virus
