Diketahui dengan baik bahwa dalam dogma sentral, RNA adalah mediator transkripsional antara ekspresi DNA dan protein.Dibandingkan dengan deteksi DNA, deteksi RNA dapat mencerminkan ekspresi gen pada organisme secara lebih objektif.Eksperimen yang melibatkan RNA meliputi: qRT-PCR, RNA-Seq, dan deteksi gen fusi, dll. Berdasarkan karakteristik RNA itu sendiri (cincin gula RNA memiliki satu gugus hidroksil bebas lebih banyak daripada cincin gula DNA), ditambah dengan sejumlah besar RNase di lingkungan, RNA lebih tidak stabil dan lebih mudah terdegradasi daripada DNA.Sampah masuk, sampah keluar, jika kualitas RNA tidak baik, maka hasil percobaan pasti tidak memuaskan, khususnya diwujudkan sebagai data yang tidak akurat atau pengulangan yang buruk.Oleh karena itu, lebih banyak perhatian harus diberikan pada pemrosesan RNA, dan tautan kontrol kualitas juga lebih penting untuk memastikan ketepatan dan keakuratan data eksperimen selanjutnya.

Untuk kontrol kualitas RNA, umumnya ada metode yang umum digunakan berikut ini:

• Spektrofotometri
• elektroforesis gel agarosa
• Bioanalyzer Agilent
• PCR kuantitatif fluoresen waktu-nyata
• Metode pewarna fluoresen Qubit

01 Spektrofotometri

RNA memiliki ikatan rangkap terkonjugasi dan memiliki puncak serapan pada panjang gelombang 260nm.Menurut hukum Lambert-Beer, kita dapat menghitung konsentrasi RNA dari puncak serapan pada 260nm.Selain itu, kami juga dapat menghitung kemurnian RNA berdasarkan rasio puncak serapan 260nm, 280nm, dan 230nm.280nm dan 230nm masing-masing adalah puncak penyerapan protein dan molekul kecil.Rasio A260/A280 dan A260/A230 kemurnian RNA yang memenuhi syarat harus lebih besar dari 2. Jika kurang dari 2, berarti ada kontaminasi protein atau molekul kecil pada sampel RNA dan perlu dimurnikan lagi.Sumber kontaminasi akan memengaruhi eksperimen hilir, seperti menghambat efisiensi amplifikasi reaksi PCR, sehingga menghasilkan hasil kuantitatif yang tidak akurat.Kemurnian RNA memiliki pengaruh besar pada hasil selanjutnya, sehingga spektrofotometri umumnya merupakan tautan kontrol kualitas yang sangat diperlukan pada langkah pertama dalam percobaan asam nukleat.

Gambar 1. Spektrum Penyerapan RNA/DNA Khas

02 Elektroforesis gel agarosa

Selain kemurnian, integritas RNA juga merupakan salah satu indikator penting untuk menilai kualitas RNA.Degradasi RNA akan menyebabkan sejumlah besar fragmen pendek dalam sampel, sehingga jumlah fragmen RNA yang dapat dideteksi secara efektif dan dicakup oleh urutan referensi akan berkurang.Integritas RNA dapat diperiksa dengan elektroforesis RNA total pada gel agarosa 1%.Metode ini dapat mengonfigurasi gel sendiri, atau menggunakan Sistem E-Gel™ prefabrikasi untuk pengujian integritas.Lebih dari 80% dari total RNA adalah RNA ribosom, yang sebagian besar terdiri dari 28S dan 18S rRNA (dalam sistem mamalia).RNA berkualitas baik akan menunjukkan dua batang terang yang jelas, yaitu batang terang 28S dan 18S, masing-masing, pada 5 Kb dan 2 Kb, dan rasionya akan cenderung mendekati 2:1.Jika dalam keadaan menyebar, itu berarti sampel RNA mungkin telah terdegradasi, dan disarankan untuk menggunakan metode yang dijelaskan nanti untuk menguji kualitas RNA lebih lanjut.

Gambar 2. Perbandingan RNA terdegradasi (jalur 2) dan RNA utuh (jalur 3) pada elektroforesis gel agarosa

03 Bioanalisis Agilent

Selain metode elektroforesis gel agarosa yang dijelaskan di atas, yang dapat membantu kami mengidentifikasi integritas RNA secara sederhana dan cepat, kami juga dapat menggunakan bioanalyzer Agilent untuk menentukan integritas RNA.Ini menggunakan kombinasi mikrofluida, elektroforesis kapiler, dan fluoresensi untuk menilai konsentrasi dan integritas RNA.Dengan menggunakan algoritme bawaan untuk menganalisis profil sampel RNA, bioanalyzer Agilent dapat menghitung nilai integritas referensi RNA, Nomor Integritas RNA (selanjutnya disebut RIN) [1].Semakin besar nilai RIN, semakin tinggi integritas RNA (1 sangat terdegradasi, 10 paling lengkap).Beberapa eksperimen yang melibatkan RNA menyarankan penggunaan RIN sebagai parameter penilaian kualitas.Mengambil percobaan sequencing throughput tinggi (selanjutnya disebut sebagai NGS) sebagai contoh, pedoman Oncomine ™ Human Immune Repertoire, yang digunakan untuk mendeteksi sel B dan reseptor antigen sel T dalam seri panel Oncomine Thermo Fisher, menunjukkan bahwa sampel dengan nilai RIN lebih besar dari 4, pembacaan dan klon yang lebih efektif dapat diukur (Gambar 3).Ada rentang rekomendasi yang berbeda untuk panel yang berbeda, dan seringkali RIN yang lebih tinggi dapat menghasilkan data yang lebih efektif.

Gambar 3, dalam eksperimen Oncomine™ Human Immune Repertoire, sampel dengan RIN lebih besar dari 4 dapat mendeteksi pembacaan dan klon sel T yang lebih efektif.【2】

Namun, nilai RIN juga memiliki beberapa keterbatasan.Meskipun RIN memiliki korelasi yang tinggi dengan kualitas data eksperimen NGS, namun tidak cocok untuk sampel FFPE.Sampel FFPE telah diolah secara kimia sejak lama, dan RNA yang diekstraksi umumnya memiliki nilai RIN yang relatif rendah.Namun, ini tidak berarti bahwa data eksperimen yang efektif harus tidak memuaskan.Untuk menilai kualitas sampel FFPE secara akurat, kami perlu menggunakan pengukuran selain RIN.Selain RIN, Agilent bioanalyzer juga dapat menghitung nilai DV200 sebagai parameter evaluasi kualitas RNA.DV200 adalah parameter yang menghitung proporsi fragmen yang lebih besar dari 200 bp dalam sampel RNA.DV200 adalah indikator kualitas sampel FFPE yang lebih baik daripada RIN.Untuk RNA yang diekstraksi dengan FFPE memiliki korelasi yang sangat tinggi dengan jumlah gen yang dapat dideteksi secara efektif dan keragaman gen [3].Meskipun DV200 dapat menutupi kekurangan dalam deteksi kualitas FFPE, bioanalyzer Agilent masih belum dapat menganalisis secara komprehensif masalah kualitas dalam sampel RNA, termasuk apakah terdapat penghambat dalam sampel.Inhibitor itu sendiri dapat memengaruhi efisiensi amplifikasi eksperimen hilir dan mengurangi jumlah data yang berguna.Untuk mengetahui apakah ada inhibitor dalam sampel, kita dapat mengadopsi metode PCR kuantitatif fluoresen real-time yang dijelaskan selanjutnya.

04 PCR kuantitatif fluoresen waktu-nyata

Metode PCR kuantitatif fluoresen real-time tidak hanya dapat mendeteksi inhibitor dalam sampel, tetapi juga secara akurat mencerminkan kualitas RNA dalam sampel FFPE.Dibandingkan dengan penganalisis biologis Agilent, instrumen kuantitatif fluoresensi real-time lebih populer di laboratorium biologi besar karena aplikasinya yang lebih luas.Untuk menguji kualitas sampel RNA, kita hanya perlu membeli atau menyiapkan probe primer untuk gen referensi internal, seperti GUSB (Cat no. Hs00939627).Dengan menggunakan rangkaian primer, probe, dan standar ini (RNA total dengan konsentrasi yang diketahui) untuk melakukan eksperimen kuantitatif absolut, konsentrasi fragmen RNA yang efektif dapat dihitung sebagai standar evaluasi kualitas RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) singkatnya).Dalam tes NGS, kami menemukan bahwa FRQ sampel RNA memiliki korelasi yang sangat tinggi dengan volume data yang efektif.Untuk semua sampel yang lebih besar dari 0,2ng/uL FRQ, setidaknya 70% pembacaan dapat secara efektif mencakup urutan referensi (Gambar 4).

Gambar 4 Nilai FRQ yang dideteksi dengan metode kuantitatif fluoresensi memiliki korelasi yang sangat tinggi (R2>0,9) dengan data efektif yang diperoleh pada percobaan NGS.Garis merah adalah nilai FRQ sama dengan 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Selain dapat diterapkan pada sampel FFPE, metode PCR kuantitatif waktu nyata juga dapat memantau inhibitor dalam sampel secara efektif.Kita dapat menambahkan sampel yang akan dideteksi ke dalam sistem reaksi dengan Kontrol Positif Internal (IPC) dan Pengujiannya, kemudian melakukan kuantifikasi fluoresensi untuk mendapatkan nilai Ct.Jika nilai Ct tertinggal dari nilai Ct dalam reaksi tanpa sampel, ini menunjukkan bahwa inhibitor ada dalam sampel dan menghambat efisiensi amplifikasi dalam reaksi.

05 Metode pewarna fluoresen Qubit

Qubit Fluorometer adalah perangkat kecil yang paling umum digunakan untuk deteksi konsentrasi dan kemurnian asam nukleat, yang mudah dioperasikan dan ada di hampir setiap laboratorium biologi molekuler.Ini secara akurat menghitung konsentrasi asam nukleat dengan mendeteksi dan pewarna fluoresen pengikat asam nukleat (reagen deteksi Qubit).Qubit memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, dan dapat secara akurat mengukur RNA hingga ke konsentrasi pg/µL.Selain kemampuan terkenal untuk mengukur konsentrasi asam nukleat secara akurat, model terbaru Thermo Fisher, Qubit 4.0, juga dapat mendeteksi integritas RNA.Sistem deteksi RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) mendeteksi integritas RNA dengan secara bersamaan mendeteksi dua pewarna fluoresen tertentu.Kedua pewarna fluoresen ini masing-masing dapat mengikat fragmen besar dan fragmen kecil RNA.Kedua pewarna fluoresen ini menunjukkan proporsi fragmen besar RNA dalam sampel, dan dari sini nilai IQ (Integritas dan Kualitas) yang mewakili kualitas RNA dapat dihitung.Nilai IQ berlaku untuk sampel FFPE dan non-FFPE, dan memiliki pengaruh besar pada kualitas pengurutan berikutnya.Mengambil eksperimen NGS sebagai contoh, dalam eksperimen uji RNA-Seq yang dilakukan pada platform Ion torrent™, sebagian besar sampel dengan nilai IQ lebih besar dari 4 memiliki setidaknya 50% pembacaan efektif (Gambar 5).Dibandingkan dengan metode deteksi yang disebutkan di atas, Qubit IQ Assay tidak hanya lebih nyaman untuk dioperasikan dan membutuhkan waktu lebih sedikit (dalam lima menit), tetapi juga memiliki korelasi yang baik antara nilai IQ parameter terukur dan kualitas data eksperimen hilir.

Gambar 5, ada korelasi besar antara nilai Qubit RNA IQ dan pembacaan RNA-Seq yang dipetakan.【5】

Melalui pengantar di atas, saya percaya bahwa setiap orang memiliki pemahaman yang cukup tentang metode kontrol kualitas RNA yang berbeda.Dalam praktiknya, Anda dapat memilihmetode yang sesuai dengan jenis sampel dan instrumen yang ada.Hanya dengan mengontrol kualitas RNA dengan baik kita dapat menghindari kegagalan percobaan berikutnya yang disebabkan oleh kualitas sampel yang buruk, sehingga menghemat waktu, tenaga dan biaya yang berharga.

Produk referensi:

Kit Isolasi RNA Total Hewan

Kit Isolasi RNA Total Sel

referensi

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: nomor integritas RNA untuk menetapkan nilai integritas pada pengukuran RNA.Biol Molekul BMC 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Panduan Pengguna Repertoar Kekebalan Manusia Oncomine (Nomor Pub. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrik Kualitas yang Ditingkatkan untuk Menilai RNA yang Berasal dari Sampel Jaringan Tertanam Formalin-Fixed Paraffin, Ilmu Toksikologi, Volume 170, Edisi 2, Agustus 2019, Halaman 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/