Kami telah berpengalaman produsen.Memenangkan mayoritas dalam sertifikasi penting di pasarnya untuk Diskon Besar China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kualitas adalah kehidupan pabrik, Fokus pada permintaan pelanggan adalah sumber kelangsungan hidup dan pengembangan perusahaan, Kami mematuhi kejujuran dan sikap kerja itikad baik, menantikan kedatangan Anda!
Kami telah berpengalaman produsen.Memenangkan mayoritas dalam sertifikasi penting pasarnyaPolimerase DNA Taq Cina, Qpcr, Perusahaan kami berjanji: harga wajar, waktu produksi singkat dan layanan purna jual yang memuaskan, kami juga menyambut Anda untuk mengunjungi pabrik kami kapan saja Anda mau.Berharap sekarang kita memiliki bisnis yang menyenangkan dan jangka panjang bersama!!!

Deskripsi

Kit ini menggunakan sistem buffer lisis unik yang dapat dengan cepat melepaskan RNA dari sampel sel kultur untuk reaksi RT-qPCR, sehingga menghilangkan proses pemurnian RNA yang memakan waktu dan melelahkan.Template RNA dapat diperoleh hanya dalam 7 menit.Reagen 5×Direct RT Mix dan 2×Direct qPCR Mix-SYBR yang disediakan oleh kit dapat dengan cepat dan efektif memperoleh hasil kuantitatif PCR secara real-time.

5×Direct RT Mix dan 2×Direct qPCR Mix-SYBR memiliki toleransi inhibitor yang kuat, dan lisat sampel dapat digunakan sebagai template untuk RT-qPCR secara langsung.Kit ini berisi transkriptase balik Foregene dengan afinitas tinggi RNA yang unik, dan DNA polimerase D-Taq Panas, dNTP, MgCl₂, penyangga reaksi, pengoptimal dan penstabil PCR.

Spesifikasi

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Komponen kit

Fitur & keuntungan

■ Sederhana dan efektif : dengan teknologi Cell Direct RT, sampel RNA dapat diperoleh hanya dalam 7 menit.

■ Permintaan sampel kecil, serendah 10 sel dapat diuji.

■ Throughput tinggi: dapat dengan cepat mendeteksi RNA dalam sel yang dikultur dalam pelat 384, 96, 24, 12, 6 sumur.

■ Penghapus DNA dapat dengan cepat menghapus genom yang dilepaskan, sangat mengurangi dampak pada hasil percobaan berikutnya.

■ Sistem RT dan qPCR yang dioptimalkan menjadikan transkripsi balik RT-PCR dua langkah lebih efisien dan PCR lebih spesifik, serta lebih tahan terhadap penghambat reaksi RT-qPCR.

Aplikasi kit

Lingkup aplikasi: sel berbudaya.

- RNA dirilis oleh lisis sampel: hanya berlaku untuk template RT-qPCR dari kit ini.

- Kit ini dapat digunakan untuk tujuan berikut: analisis ekspresi gen, verifikasi efek pembungkaman gen yang dimediasi siRNA, skrining obat, dll.

Diagram

Penyimpanan dan Umur simpan

Bagian I dari kit ini harus disimpan pada suhu 4℃;Bagian II harus disimpan pada -20 ℃.

Foregene Protease Plus II harus disimpan pada suhu 4℃, jangan dibekukan pada suhu -20℃.

Reagen 2×Direct qPCR Mix-SYBR harus disimpan pada suhu -20℃ dalam gelap;jika sering digunakan, itu juga dapat disimpan pada suhu 4 ℃ untuk penyimpanan jangka pendek (habiskan dalam 10 hari). Kami telah berpengalaman produsen.Memenangkan mayoritas dalam sertifikasi penting dari pasarnya untuk Diskon besar China Sensitivitas Tinggi One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Kualitas adalah kehidupan pabrik, Fokus pada permintaan pelanggan adalah sumber kelangsungan hidup dan pengembangan perusahaan, Kami mematuhi kejujuran dan sikap kerja itikad baik, menantikan kedatangan Anda!
Diskon besarPolimerase DNA Taq Cina, Qpcr, Perusahaan kami berjanji: harga wajar, waktu produksi singkat dan layanan purna jual yang memuaskan, kami juga menyambut Anda untuk mengunjungi pabrik kami kapan saja Anda mau.Berharap sekarang kita memiliki bisnis yang menyenangkan dan jangka panjang bersama!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Untuk sel langsung RT-qPCR menggunakan ≤ 1000.000 sel

Perkenalan produk

Produk ini menggunakan sistem buffer lisis yang unik untuk melepaskan RNA dengan cepat dari sampel sel yang dikultur untuk reaksi RT-qPCR, menghilangkan proses pemurnian RNA yang memakan waktu dan melelahkan, dan hanya 7 menit untuk mendapatkan template RNA yang diperlukan, dengan 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman yang disediakan oleh kit dapat dengan cepat dan efisien memperoleh hasil PCR kuantitatif waktu nyata.

5× Direct RT Mix dan 2× Direct qPCR Mix-Taqman memiliki toleransi inhibitor yang kuat dan dapat melakukan pembalikan yang efisien dan amplifikasi spesifik menggunakan lisat sampel yang akan diukur sebagai template.Reagen mengandung Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer dan Stabilizer, yang dapat digunakan dengan buffer lisis untuk mendeteksi sampel dengan cepat dan mudah, serta memiliki karakteristik sensitivitas, spesifisitas, dan stabilitas yang tinggi.

Fitur Produk

Teknologi Cell Direct RT yang sederhana dan efektif hanya membutuhkan waktu 7 menit untuk mendapatkan sampel RNA.

Persyaratan sampel kecil, dan minimal 10 sel kultur dapat digunakan untuk eksperimen.

Throughput tinggi untuk akuisisi RNA cepat dari sel yang dikultur seperti pelat 384, 96, 24, 12, dan 6 sumur.

Penghapus DNA dapat dengan cepat menghapus genom yang dilepaskan, sangat mengurangi dampak pada hasil eksperimen selanjutnya.

Sistem RT dan qPCR yang dioptimalkan memungkinkan RT-PCR dua langkah dengan transkripsi balik yang lebih efisien, spesifisitas, dan toleransi penghambat reaksi RT-qPCR yang lebih kuat.

Aplikasi kit

Lingkup aplikasi: Sel kultur.

Sampel lisis menginterpretasikan RNA: hanya digunakan sebagai templat RT-qPCR dua langkah.

Kit dapat digunakan untuk tujuan berikut: analisis ekspresi pengaturan gen, pengujian alel, skrining obat, dll.

Keterbatasan kit

Fragmen yang diamplifikasi ≤ 300 bp.

Kit digunakan untuk membiakkan sel baru.

Kontrol kualitas produk

Menurut Sistem Manajemen Kualitas Total FOREGENE, setiap batch kit seri Cell Direct RT-qPCR diuji secara ketat beberapa kali untuk memastikan keandalan dan stabilitas kualitas setiap batch kit.

Isi kit

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman dapat dibeli secara terpisah, detailnya tersedia di Lampiran 1 (HALAMAN 13).

Kondisi penyimpanan

1. Ketentuan Pengiriman

Seluruh proses transportasi kotak paket es suhu rendah, untuk memastikan bahwa kit dalam keadaan <4 ° C.

2. Kondisi penyimpanan

Simpan bagian I pada suhu 4°C dan Bagian II pada -20°C.

Foregene Protease Plus II harus disimpan pada suhu 4°C, tidak dibekukan pada suhu -20°C.

Reagen 2× Direct qPCR Mix-Taqman disimpan pada suhu -20°C, atau pada suhu 4°C untuk penggunaan jangka pendek jika sering digunakan (dalam 10 hari).

Informasi komponen kit

Buffer CL: Menyediakan lingkungan yang diperlukan untuk reaksi lisis sel.

Buffer ST: Menghentikan zat aktif dalam lisat untuk menghindari efek pada RT selanjutnya.

Penghapus DNA: Penghilang DNA, efek menghilangkan genom pada percobaan selanjutnya.

5× Direct RT Mix: Mengandung RNA afinitas tinggi Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizer, enhancer, optimizer, dan reverse transcription primers untuk penyelarasan optimal (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Dalam konteks buffer lisis, sel dilisiskan untuk melepaskan asam nukleat.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Reagen ini mengandung Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, penyangga reaksi, pengoptimal PCR, dan penstabil.

20× Pewarna Referensi ROX: Umumnya digunakan pada instrumen amplifikasi PCR Real Time dari ABI, Stratagene dan perusahaan lain, digunakan untuk menyesuaikan perbedaan antara tabung PCR dan tabung yang disebabkan oleh kesalahan dosis PCR.Konsentrasi Pewarna Referensi 20× ROX yang diperlukan untuk instrumen berbeda berbeda, dan pengguna dapat menambahkannya sesuai dengan konsentrasi instrumen yang disarankan.

ddH bebas RNase₂O: Air ultra murni steril bebas RNase untuk reaksi RT-qPCR dua langkah.

Tindakan pencegahan:(Pastikan untuk membaca tindakan pencegahan dengan hati-hati sebelum menggunakan kit)

Perhatikan metode operasi percobaan untuk menghindari kontaminasi silang antar sampel.

Perhatikan kebersihan lingkungan percobaan dan peralatan untuk menghindari kontaminasi RNase dan degradasi RNA.

Ambil sampel sel segar atau terawetkan dengan baik dan jangan pernah menggunakan sampel sel yang dibekukan berulang kali.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman harus menghindari freeze-thaw berulang, jika tidak maka akan mempengaruhi transkripsi balik dan efisiensi PCR.

Persiapanransumsebelumoperasi

Pastikan untuk membaca instruksi dengan seksama sebelum menggunakan kit ini.Cell Direct RT-qPCR Kit sederhana, nyaman, dan cepat dioperasikan, dan petunjuknya memberikan informasi lengkap tentang seluruh kit dan cara menggunakannya dengan benar.Harap siapkan bahan dan peralatan percobaan yang diperlukan sebelum digunakan.

Bahan dan peralatan percobaan

◆ Kultur sel.

◆ 1,5 ml atau 2 ml, tabung centrifuge bebas RNase-/DNase, ujung bebas RNase-/DNase, tabung qPCR steril 0,2 ml.

◆ mesin qPCR, pipet, centrifuge meja (≥13.400×g) (tergantung pada kebutuhan eksperimental), dll.

Keamanan

◆ Produk ini hanya untuk tujuan penelitian ilmiah, harap jangan menggunakannya untuk tujuan farmasi, klinis, makanan, dan kosmetik.

◆ Saat menggunakan bahan kimia, kenakan pakaian lab yang sesuai, sarung tangan, kaca mata pelindung, dll.

Operasipanduan

Sistem Lisis Sel, sistem RT, dan paket suplemen larutan reaksi qPCR dapat dibeli secara terpisah, untuk perincian di Lampiran 1 (HALAMAN 13).

Panduan operasi

A: Sampel rilis RNA

1. Sel diberi perlakuan awal: Cuci pelat kultur sel dengan PBS dingin, lalu lisis sel (10-10⁶), 10⁶ dari jumlah sel, direkomendasikan Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) atau Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) untuk ekstraksi dan pemurnian RNA.

1.1.Sel yang melekat (pelat 24 sumur sebagai contoh)

1.1.1.Tentukan jumlah sel pada setiap well, tentukan jumlah sel 1×10⁵, dan gunakan pipet untuk mengeluarkan media biakan dari cawan biakan.

1.1.2.Tambahkan 200 μl pra-dingin 1 × PBS ke masing-masing sumur.Jangan memipet berulang kali dan keluarkan PBS dari sumur.Miringkan pelat dan keluarkan PBS sebanyak mungkin.Lanjutkan ke langkah 2.

1.1.3.Cawan kultur sel yang berbeda atau tabel nomor referensi 1-1 dalam cawan kultur sel ditambahkan pradingin 1 × PBS untuk pencucian sel.

Tabel 1-1: Dosis PBS untuk jumlah sel yang berbeda

Catatan：Untuk memastikan sel yang melekat kuat，sejumlah besar kehilangan sel dihindari saat mencuci.

1.2.Sel suspensi atau sel yang melekat dikultur dalam pelat yang tidak berpori

1.2.1.Sel-sel yang melekat dikultur dalam non-multiwell plate (sel suspensi dimulai dari langkah 1.2.2 berikutnya), kumpulkan dan pisahkan sel-sel sesuai dengan metode pengumpulan sel normal, dan tempatkan dalam piring kultur atau tabung sentrifus;jika trypsinization digunakan, memerlukan sentrifugasi untuk mengumpulkan sel dan untuk menghilangkan sisa tripsin, ditambahkan PBS yang disuspensikan kembali ke dalam sel individu untuk membubarkan sel.

1.2.2.Setelah jumlah sel dihitung, alikuot sel 1×10⁵ satu ke tabung sentrifus, kumpulkan sel dengan sentrifugasi pada 1000 × g selama 10 menit.

1.2.3.Tambahkan 200 µl PBS ke dalam tabung centrifuge, jangan dipipet berulang kali, dan langsung aspirasikan PBS.lanjutkan ke langkah 2. (Jika sulit mengendap dan sel diresuspensi kembali, dapat dilakukan sentrifugasi 1000×g 10 menit setelah supernatan dibuang, pelet sel dilanjutkan ke langkah 2)

2. Lisis sel: Hapus Buffer CL, suhunya diseimbangkan dengan suhu kamar, Penghapus DNA dan Foregene Protease Plus II, sesuai tabel berikut 1-2 sistem lisis yang disiapkan: (Larutan lisis siap digunakan).

Tabel 1-2: belahan dada persiapan sistem (Catatan: dalam persiapan di atas es)

3. (Pelat 24-sumur sebagai contoh) Pipet 200 μl campuran master lisis sel ke dalam masing-masing sumur, Tiup berulang kali 5-10 kali, Inkubasi pada suhu kamar (20-25 ℃) selama 5 menit.

Catatan：Untuk menghindari pembentukan gelembung, harap sesuaikan skala pipet saat memipet menjadi 200μl atau kurang.Sel mungkin tampak keruh setelah lisis, yang normal.

4.(Pelat 24 sumur sebagai contoh) ditambahkan dalam cairan 20 μl Buffer ST (sistem lisis yang berbeda Buffer ST ditambahkan dalam jumlah yang ditunjukkan pada Tabel 1-3), pemipetan berulang 5-10 kali, pada suhu kamar (20-25 ℃) diinkubasi selama 2 menit.

Catatan：Ujung pipet dibuang di bawah permukaan, memastikan bahwa lisat telah ditambahkan，untuk menghindari pembentukan gelembung, harap saat memipet skala pipet disesuaikan menjadi 200μl atau kurang.

Tabel 1-3：Tambahkan Penyangga ST

5. Lisat digunakan untuk percobaan RT-qPCR selanjutnya.Jika percobaan selanjutnya tidak dapat dilakukan tepat waktu, simpan di dalam es tidak lebih dari 2 jam, dan simpan pada suhu -20℃ atau -80 ℃ (tidak lebih dari tiga bulan).

B: Persiapan sistem RT

1. Keluarkan 5 × Direct RT Mix dan letakkan di atas penangas es, biarkan meleleh secara alami, dan aduk perlahan untuk digunakan nanti;keluarkan ddH2O Bebas RNase dan lelehkan dan letakkan di penangas es untuk digunakan nanti.Siapkan sistem reaksi pada es menurut Tabel 2-1 di bawah ini.

Tabel 2-1: Pembuatan sistem reaksi RT

2.Setelah formulasi sistem selesai, dicampur dengan lembut dan disentrifugasi sebentar dalam tabel berikut 2 -2 kondisi reaksi reaksi RT.

Tabel 2-2: Pengaturan kondisi Reaksi RT

3. Setelah reaksi selesai, produk reaksi ditempatkan langsung di atas es untuk qPCR, harap letakkan pelestarian jangka panjang -20 ℃ atau -80 ℃.

Catatan: Karena penggunaan cetakan yang tidak dimurnikan, endapan putih dapat muncul pada produk transkripsi terbalik.Ini adalah fenomena normal.Centrifuge supernatan segera untuk percobaan selanjutnya.

Larutan reaksi RT yang dihasilkan ditambahkan ke sistem reaksi PCR Tahap Real Time berikutnya, disarankan untuk menambahkan jumlah mulai dari 10-30% dari sistem reaksi.

C: persiapan sistem reaksi qPCR

1.Jumlah B yang sesuai disiapkan dalam templat cDNA langkah sesuai dengan tabel 3-1 berikut untuk menyiapkan sistem reaksi.

Catatan: Jumlah templat cDNA menyumbang 10-30% dari sistem qPCR.Misalnya, dalam sistem qPCR 20μl, tambahkan 2-6 μl buffer lisis, tetapi tidak lebih dari 6 μl.

2.Optimasi kondisi qPCR yang baik (Suhu anil, dll.) untuk reaksi qPCR (Kondisi reaksi diberikan pada Tabel 3-2).

Catatan: Coba gunakan kondisi yang dioptimalkan untuk reaksi qPCR untuk mendapatkan hasil yang lebih baik.

Tabel 3-1: Persiapan sistem reaksi PCR

1*: Konsentrasi primer dapat disesuaikan dalam kisaran 50-900 nM ketika kinerja reaksi primer buruk.

Catatan: Sistem qPCR dapat disesuaikan dengan kebutuhan eksperimental dan model pengendara sepeda fluoresensi.Untuk qPCR dalam 50μl sistem, sesuaikan dosis reagen secara proporsional sesuai dengan 20μl sistem.

2*: Pilih konsentrasi akhir Pewarna Referensi ROX yang sesuai dengan siklus termal kuantitatif fluoresensi.Konsentrasi Pewarna Referensi ROX yang paling tepat untuk siklus kuantitatif fluoresensi umum ditunjukkan pada tabel di bawah ini:

Tabel 3-2: kondisi reaksi qPCR disediakan

Catatan: Untuk mendapatkan efek qPCR terbaik, PCR gradien dapat digunakan untuk mengoptimalkan kondisi reaksi untuk templat dan primer yang berbeda.Kondisi reaksi PCR bervariasi tergantung pada penganalisa fluoresensi, templat, primer, dll. Dalam operasi tertentu, kondisi reaksi optimal perlu dirancang sesuai dengan kondisi spesifik dari siklus termal kuantitatif fluoresensi, jenis templat, ukuran fragmen yang diinginkan, urutan dasar dari fragmen yang diamplifikasi dan konten GC dan panjang primer, termasuk suhu anil, waktu reaksi, dll.

Prinsip desain primer PCR Real Time

Maju Primer dan Reverse Primer

Untuk Real Time PCR, desain primer sangat penting.Primer terkait dengan spesifisitas dan efisiensi amplifikasi PCR, dan dapat dirancang dengan mengacu pada prinsip-prinsip berikut:

◆ Panjang primer: 18-30bp.

◆ konten GC: 40-60%.

◆ Nilai Tm: Perangkat lunak desain primer, seperti Primer 5, dapat memberikan nilai Tm dari primer.Nilai Tm primer upstream dan downstream harus sedekat mungkin.Rumus perhitungan Tm juga dapat digunakan: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Saat melakukan PCR, suhu di bawah nilai Tm primer 5 °C umumnya dipilih sebagai suhu anil (peningkatan suhu anil yang sesuai dapat meningkatkan spesifisitas reaksi PCR).

◆ Primer dan produk PCR:

◆ Desain panjang produk amplifikasi PCR primer sebaiknya 100-150bp.

◆ Primer desain di area struktural sekunder dari template harus dihindari sebisa mungkin.

◆ Hindari pembentukan 2 atau lebih basa komplementer antara ujung 3′ primer hulu dan hilir.

◆ Basis terminal Primer 3′ tidak dapat hadir dengan 3 tambahan berturut-turut G atau C.

◆ Primer itu sendiri tidak dapat memiliki struktur pelengkap, jika tidak, struktur jepit rambut akan terbentuk, yang memengaruhi amplifikasi PCR.

◆ ATCG harus didistribusikan secara merata dalam urutan primer, dan basis terminal 3′ harus dihindari sebagai T.

Lampiran1：Cell LangsungRT-qPCR Komponen kitpaket suplemen t

1. Solusi Lisis Sel