Eksperimen RT-qPCR meliputi ekstraksi RNA dan penilaian kualitas, transkripsi balik dan qPCR tiga langkah, setiap langkah memiliki banyak tindakan pencegahan, kami akan memperkenalkan secara rinci di bawah ini.

Ⅰ.penilaian kualitas RNA

Dalam percobaan RT-qPCR, setelah ekstraksi RNA selesai, kualitas RNA perlu dievaluasi, dan percobaan lanjutan hanya dapat dilakukan setelah memenuhi syarat.Metode evaluasi meliputi spektrofotometer, elektroforesis gel Agilent, analisis Agilent 2100, di antaranya spektrofotometer yang paling umum digunakan dan metode deteksi elektroforesis gel agarosa.Perlu dicatat bahwa kedua metode ini perlu digunakan bersama untuk menyelesaikan deteksi dan analisis konsentrasi, kemurnian dan integritas RNA, untuk memastikan kualitas RNA.

Kit Isolasi RNA Terkait: 

Kit Isolasi RNA Total Sel

Total RNA yang sangat murni dan berkualitas tinggi dapat diperoleh dari berbagai sel yang dikultur dalam 11 menit.

Kit Isolasi RNA Total Hewan

Dengan cepat dan efisien mengekstrak RNA total dengan kemurnian tinggi dan berkualitas tinggi dari berbagai jaringan hewan.

Spektrofotometer:

Spektrofotometer terutama digunakan untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian RNA, tetapi tidak dapat mendeteksi integritas RNA dan residu genomik.Diantaranya, A260/280 dan A260/230 adalah parameter penting untuk deteksi kemurnian RNA, dan kemurnian RNA dapat dideteksi sesuai dengan fluktuasi nilainya:

1. 1.9< A260/280< 2.1, menunjukkan bahwa kemurnian RNA baik;A260/280<1.9, menunjukkan bahwa mungkin terdapat residu protein pada RNA;A260/280>2.1, menunjukkan kemungkinan degradasi parsial RNA, yang selanjutnya dapat dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa.

2. 2.0< A260/230< 2.2, menunjukkan bahwa kemurnian RNA baik;A260/230< 2.0, menunjukkan bahwa mungkin terdapat residu reagen organik pada RNA, seperti fenol, etanol atau gula.

Elektroforesis gel agarosa:

Uji elektroforesis gel agarosa dapat menganalisis integritas RNA, genom, dan residu protein, tetapi tidak dapat secara akurat mengukur konsentrasi RNA atau mendeteksi residu reagen organik.Ambil templat RNA eukariotik misalnya:

1. RNA menjadi sasaran elektroforesis gel agarosa.Jika hanya ada tiga pita tunggal 28sRNA, 18sRNA dan 5.8sRNA pada peta gel, ini menunjukkan bahwa RNA yang diekstraksi masih utuh.Jika ada fenomena menyeret, itu menunjukkan degradasi parsial RNA.

2. Jika ada pita terang tunggal antara lubang lem dan pita 28sRNA, mungkin ada residu DNA genomik.

3. Jika pita muncul di lubang lem, ini menunjukkan bahwa mungkin ada residu protein dan zat makromolekul lainnya.

Ⅱ. Membalikkan transkripsi

Setelah ekstraksi RNA selesai, perlu dibalik menjadi cDNA untuk percobaan selanjutnya, sehingga langkah pembalikan sangat penting.Reverse transcriptase akan diperkenalkan dari pemilihan reverse transcriptase dan primer:

Pemilihan transkriptase terbalik:

Reverse transcriptase tipikal termasuk AMV RTase dan MMLV RTase.RNase H dari AMV RTase memiliki aktivitas yang kuat, panjang sintesis pendek, jumlah sintesis rendah dan stabilitas termal yang baik (42 ~ 55 ℃).Aktivitas RNase H dari MMLV RTase lemah, panjang sintesisnya panjang, jumlah sintesisnya tinggi, dan stabilitas termalnya buruk (37 ~ 42 ℃).

Karena enzim RNase H memiliki fungsi mendegradasi templat RNA, MMLV dengan aktivitas RNase H yang lemah harus dipilih secara istimewa selama transkripsi terbalik, dan setelah rekayasa genetika selanjutnya, stabilitas termal MMLV telah mencapai lompatan kualitatif.Mengambil ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV untuk transkripsi terbalik) sebagai contoh, itu adalah reverse transcriptase baru yang diekspresikan dalam bakteri rekayasa E. coli menggunakan teknologi rekombinasi genetik.Ini adalah polimerase DNA rekombinan yang mensintesis untai DNA komplementer dari RNA untai tunggal, DNA, atau RNA:DNA hibrida.Ia tidak memiliki aktivitas RNase H, stabilitas yang kuat, afinitas RNA yang kuat, dan sensitivitas deteksi yang tinggi.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV untuk transkripsi terbalik)

Pemilihan primer:

Umumnya primer RT terbagi dalam tiga kategori: oligo dT, primer acak, dan primer spesifik gen.Pilih primer yang cocok untuk digunakan sesuai dengan persyaratan eksperimental yang berbeda.

1. Jika templat berasal dari eukariotik dan cDNA akhir digunakan untuk amplifikasi PCR rutin, Oligo (dT) direkomendasikan;Jika percobaan selanjutnya hanya digunakan untuk qPCR, Oligo (dT) direkomendasikan untuk dicampur dengan primer acak untuk meningkatkan efisiensi transkripsi balik.

2. Jika templat berasal dari prokariota, Primer Acak atau primer spesifik gen harus dipilih untuk transkripsi terbalik.

Ⅲ.qPCR

Kuantifikasi fluoresensi terutama dijabarkan dari pemilihan metode kuantitatif, prinsip desain primer, pemilihan ROX, konfigurasi sistem reaksi dan pengaturan kondisi reaksi, dll.

Pemilihan metode kuantitatif:

Metode kuantitatif dibagi menjadi metode kuantitatif relatif dan metode kuantitatif absolut.Kuantifikasi relatif dapat digunakan untuk mendeteksi pengaruh metode pengobatan tertentu pada ekspresi gen, mendeteksi perbedaan ekspresi gen pada waktu yang berbeda dan membandingkan perbedaan ekspresi gen pada jaringan yang berbeda.Kuantifikasi absolut dapat mendeteksi jumlah asam nukleat dalam virus dan seterusnya.Saat melakukan eksperimen, kita harus memilih metode kuantitatif yang sesuai dengan eksperimen kita sendiri.

Prinsip desain primer:

Desain primer untuk qPCR berhubungan langsung dengan efisiensi amplifikasi dan spesifisitas produk.Oleh karena itu, mendesain primer yang baik dengan benar adalah langkah pertama qPCR yang sukses.Dalam desain primer, prinsip-prinsip berikut harus diperhatikan ketika memenuhi prinsip desain primer konvensional:

1. Panjang fragmen target dikontrol antara 100 dan 300 bp;

2. Desain cross-exon untuk menghindari pengaruh DNA genomik;

3. Primer yang dirancang perlu diuji untuk efisiensi amplifikasi, dan hanya ketika efisiensi amplifikasi mencapai standar (90-110%) barulah dapat digunakan untuk percobaan kuantitatif;

4. Konsentrasi primer biasanya dioptimalkan antara 0,1uM dan 1,0uM.

Pilihan dariROX:

Dalam proses reaksi kuantitatif, ROX dapat menyesuaikan perbedaan jalur optik, kesalahan pemipetan, atau perbedaan volume yang disebabkan oleh penguapan dan kondensasi secara seragam, sehingga meningkatkan keterulangan hasil.Namun, perlu dicatat bahwa pemilihan ROX terkait dengan instrumennya.Jika instrumen qPCR memiliki fungsi mengoreksi perbedaan lubang secara otomatis, tidak perlu menambahkan ROX;jika tidak, perlu menambahkan koreksi ROX.Mitra kecil dalam membeli reagen harus sesuai dengan instrumen yang digunakan untuk memilih ROX yang benar, menghindari kesalahan di kemudian hari.

Persiapan sistem reaksi:

Volume reaksi 20ul dan 50ul lebih disukai.Hal-hal berikut harus diperhatikan ketika sistem dirumuskan:

1. Sistem reaksi perlu disiapkan dengan ventilasi di meja kerja ultra-bersih, ddH baru₂O digunakan untuk setiap percobaan;

2. Setiap percobaan perlu menyiapkan NTC untuk memverifikasi apakah ada polusi dalam sistem, dan setiap pasangan primer perlu melakukan NTC saat menyiapkan sistem;

3. Untuk mendeteksi apakah terdapat residu gDNA dalam template RNA, NRT dapat disiapkan untuk setiap sampel untuk dideteksi;

4. Saat menyiapkan sistem, disarankan untuk melakukan setidaknya 3 pengulangan teknis untuk satu sampel;

5. Jika templatnya adalah cDNA, disarankan untuk mengencerkan 5-10 kali untuk mengurangi efek penghambatan sistem transkripsi terbalik pada percobaan qPCR.Lebih baik menjelajahi kuantitas template dengan gradien, sehingga nilai CT turun antara 20-30;

6. Tentukan jumlah reaksi yang diperlukan, tingkatkan 5-10% berdasarkan jumlah reaksi, dan hitung nomor konfigurasi volume;

7, sistem disiapkan menggunakan prinsip premix, pencampuran setelah sentrifugasi dan memastikan tidak ada gelembung;

8, Sedapat mungkin untuk memilih bahan habis pakai pendukung.

Kit RT-qPCR terkait