PCR kuantitatif fluoresensi (juga dikenal sebagai TaqMan PCR, selanjutnya disebut FQ-PCR) adalah teknologi kuantitatif asam nukleat baru yang dikembangkan oleh PE (Perkin Elmer) di Amerika Serikat pada tahun 1995. Teknologi ini didasarkan pada PCR konvensional dengan menambahkan probe berlabel neon.Dibandingkan dengan PCR fleksibel, FQ-PCR memiliki banyak keunggulan untuk mewujudkan fungsi kuantitatifnya.Artikel ini bermaksud untuk menjelaskan secara singkat karakteristik, prinsip, metode, dan aplikasi teknologi.
1 Fitur
FQ-PCR tidak hanya memiliki sensitivitas tinggi dari PCR biasa, tetapi juga karena penerapan probe fluoresen, ia dapat secara langsung mendeteksi perubahan sinyal fluoresen selama amplifikasi PCR melalui sistem konduksi fotolistrik untuk mendapatkan hasil kuantitatif, yang mengatasi banyak kekurangan PCR konvensional, sehingga juga memiliki spesifisitas hibridisasi DNA yang tinggi dan akurasi teknologi spektroskopi yang tinggi.
Misalnya, produk PCR umum perlu diamati dengan elektroforesis gel agarosa dan pewarnaan etidium bromida dengan sinar ultraviolet atau dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan pewarnaan perak.Ini tidak hanya membutuhkan banyak instrumen, tetapi juga membutuhkan waktu dan usaha.Noda yang digunakan Ethidium bromide berbahaya bagi tubuh manusia, dan prosedur eksperimental yang rumit ini memberikan peluang untuk polusi dan positif palsu.Namun, FQ-PCR hanya perlu membuka tutup sekali selama pemuatan sampel, dan proses selanjutnya adalah operasi tabung tertutup sepenuhnya, yang tidak memerlukan pasca-pemrosesan PCR, menghindari banyak kelemahan dalam operasi PCR konvensional.Eksperimen ini umumnya menggunakan thermal cycler PCR ABI7100 yang dikembangkan oleh perusahaan PE.
Instrumen ini memiliki karakteristik sebagai berikut: ① Aplikasi luas: Dapat digunakan untuk kuantifikasi produk PCR DNA dan RNA, penelitian ekspresi gen, deteksi patogen, dan optimalisasi kondisi PCR.② Prinsip kuantitatif unik: Menggunakan probe berlabel berfluoresensi, jumlah fluoresensi akan terakumulasi dengan siklus PCR setelah eksitasi laser, untuk mencapai tujuan kuantifikasi.③ Efisiensi kerja tinggi: Thermal cycler 9600 PCR bawaan, dikendalikan komputer 1 hingga 2 jam untuk menyelesaikan amplifikasi dan kuantifikasi 96 sampel secara otomatis dan sinkron.④ Tidak perlu elektroforesis gel: Tidak perlu mengencerkan dan mengelektroforesis sampel, cukup gunakan probe khusus untuk mendeteksi langsung di tabung reaksi.⑤Tidak ada polusi dalam saluran pipa: Tabung reaksi tertutup yang unik dan sistem konduksi fotolistrik diadopsi, sehingga tidak perlu khawatir tentang polusi.⑥Hasil dapat direproduksi: rentang dinamis kuantitatif hingga lima kali lipat.Oleh karena itu, sejak teknologi ini berhasil dikembangkan, telah dihargai oleh banyak peneliti ilmiah dan telah diterapkan di berbagai bidang.
2 Prinsip dan metode
Prinsip kerja FQ-PCR adalah menggunakan aktivitas eksonuklease 5′→3′ dari enzim Taq untuk menambahkan probe berlabel berfluoresensi ke sistem reaksi PCR.Probe dapat secara khusus berhibridisasi dengan cetakan DNA yang terdapat dalam urutan primer.Ujung 5′ probe diberi label dengan gen emisi fluoresensi FAM (6-carboxyfluorescein, puncak emisi fluoresensi pada 518nm), dan ujung 3′ diberi label dengan Grup quenching fluoresensi TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, puncak emisi fluoresensi pada 582nm), awal 3′ dari probe difosforilasi untuk mencegah probe diperpanjang selama amplifikasi PCR.Ketika probe tetap utuh, kelompok quencher menekan emisi fluoresensi dari kelompok pemancar.Setelah kelompok pemancar dipisahkan dari kelompok pendinginan, penghambatan diangkat, dan kerapatan optik pada 518nm meningkat dan terdeteksi oleh sistem deteksi fluoresensi. Pada fase renaturasi, probe berhibridisasi dengan DNA cetakan, dan enzim Taq pada fase ekstensi bergerak sepanjang cetakan DNA dengan perpanjangan primer.Saat probe terputus, efek pendinginan dilepaskan dan sinyal fluoresen dilepaskan.Setiap kali templat disalin, sebuah probe terputus, disertai dengan pelepasan sinyal fluoresen.Karena ada hubungan satu-ke-satu antara jumlah fluorofor yang dilepaskan dan jumlah produk PCR, teknik ini dapat digunakan untuk menghitung cetakan secara akurat.Instrumen eksperimen umumnya menggunakan thermal cycler PCR ABI7100 yang dikembangkan oleh perusahaan PE, dan thermal cycler lainnya juga dapat digunakan.Jika sistem reaksi tipe reaksi ABI7700 digunakan untuk percobaan, setelah reaksi selesai, hasil kuantitatif dapat langsung diberikan melalui analisis komputer.Jika Anda menggunakan thermal cycler lainnya, Anda perlu menggunakan detektor fluoresensi untuk mengukur sinyal fluoresensi dalam tabung reaksi pada saat yang sama untuk menghitung RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ mewakili rasio intensitas pendaran dari kelompok emisi fluoresen dari tabung sampel terhadap intensitas pendaran dari kelompok quenching, RQ- mewakili rasio keduanya dalam tabung kosong, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) mewakili jumlah perubahan sinyal fluoresensi selama PCR Setelah pemrosesan data, hasil kuantitatif dapat diperoleh.Karena pengenalan probe fluoresen, spesifisitas percobaan meningkat secara signifikan.Desain probe umumnya harus memenuhi ketentuan berikut: ①Panjang probe harus sekitar 20-40 basis untuk memastikan spesifisitas pengikatan.②Konten basis GC adalah antara 40% dan 60% untuk menghindari duplikasi urutan nukleotida tunggal.③ Hindari hibridisasi atau tumpang tindih dengan primer.④ Stabilitas pengikatan antara probe dan templat lebih besar daripada stabilitas pengikatan antara primer dan templat, sehingga nilai Tm probe harus setidaknya 5°C lebih tinggi dari nilai Tm primer.Selain itu, konsentrasi probe, homologi antara probe dan urutan template, serta jarak antara probe dan primer semuanya berdampak pada hasil eksperimen.
Produk-produk terkait:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Produsen dan Pemasok |Foregene (foreivd.com)
Waktu posting: 15 Okt-2021
