Dasar desain primer (99% masalah dapat diselesaikan)
1. Panjang primer: Buku teks membutuhkan 15-30bp, biasanya sekitar 20bp.Kondisi sebenarnya lebih baik menjadi 18-24bp untuk memastikan spesifisitas, tetapi semakin lama semakin baik, primer yang terlalu lama juga akan menurunkan spesifisitas, dan menurunkan hasil.
2. Rentang amplifikasi primer: 200-500bp sesuai, dan fragmen dapat diperluas hingga 10kb dalam kondisi tertentu.
3. Basis primer: Kandungan G+C harus 40-60%, terlalu sedikit efek amplifikasi G+C tidak baik, terlalu banyak G+C mudah untuk menampilkan pita non-spesifik.ATGC paling baik didistribusikan secara acak, menghindari kelompok lebih dari 5 nukleotida purin atau pirimidin.Multi-gc untuk urutan 5′ ujung dan perantara untuk meningkatkan stabilitas, hindari GC kaya di ujung 3′, tanpa GC untuk 3 basa terakhir, atau tanpa GC untuk 3 dari 5 basa terakhir.
4. Hindari struktur sekunder pada primer, dan hindari komplemen antara dua primer, terutama komplemen pada ujung 3', jika tidak primer dimer akan terbentuk dan band amplifikasi non-spesifik akan dihasilkan.
5. Basis pada ujung primer 3 ', terutama basis terakhir dan kedua dari belakang, harus dipasangkan secara ketat untuk menghindari kegagalan PCR karena basis terminal yang tidak berpasangan.
6. Primer memiliki atau dapat ditambahkan dengan situs pembelahan yang sesuai, dan urutan target yang diamplifikasi sebaiknya memiliki situs pembelahan yang sesuai, yang sangat bermanfaat untuk analisis pembelahan atau kloning molekuler.
7. Spesifitas primer: primer seharusnya tidak memiliki homologi yang jelas dengan sekuens lain dalam database sekuen asam nukleat.
8. Belajar menggunakan perangkat lunak: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Desain online ini berfungsi paling baik).
Konten di atas dapat menyelesaikan setidaknya 99% masalah desain primer.
Kontrol detail desain primer
1. Panjang primer
Panjang primer umum adalah 18~30 basis.Secara umum, faktor terpenting yang menentukan suhu anil primer adalah panjang primer.Suhu anil primer umumnya dipilih (nilai Tm -5 ℃), dan beberapa langsung menggunakan nilai Tm.Rumus berikut dapat digunakan untuk menghitung secara kasar suhu anil primer.
Ketika panjang primer kurang dari 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Ketika panjang primer lebih besar dari 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/panjang-5℃
Selain itu, banyak perangkat lunak juga dapat digunakan untuk menghitung suhu anil, prinsip perhitungannya akan berbeda, sehingga terkadang nilai yang dihitung mungkin memiliki celah kecil.Untuk mengoptimalkan reaksi PCR, primer terpendek yang memastikan suhu anil tidak kurang dari 54℃ digunakan untuk efisiensi dan spesifisitas terbaik.
Secara keseluruhan, spesifisitas primer meningkat dengan faktor empat untuk setiap nukleotida tambahan, sehingga panjang primer minimum untuk sebagian besar aplikasi adalah 18 nukleotida.Batas atas panjang primer tidak terlalu penting, terutama berkaitan dengan efisiensi reaksi.Karena entropi, semakin panjang primer, semakin rendah laju anil untuk berikatan dengan DNA target untuk membentuk templat beruntai ganda yang stabil untuk mengikat DNA polimerase.
Saat menggunakan perangkat lunak untuk mendesain primer, panjang primer dapat ditentukan oleh nilai TM pada gilirannya, terutama untuk primer PCR kuantitatif fluoresensi, TM = 60 ℃ atau lebih harus dikontrol.
2.GC konten
Secara umum, kandungan G+C dalam urutan primer adalah 40%~60%, dan kandungan GC dan nilai Tm dari sepasang primer harus dikoordinasikan.Jika primer memiliki kecenderungan GC atau AT yang serius, jumlah ekor A, T atau G dan C yang sesuai dapat ditambahkan ke ujung primer 5 '.
3. Suhu anil
Suhu anil harus 5 ℃ lebih rendah dari suhu unchain.Jika jumlah basa primer sedikit, suhu annealing dapat dinaikkan dengan tepat, yang dapat meningkatkan spesifisitas PCR.Jika jumlah basa besar, suhu anil dapat dikurangi dengan tepat.Perbedaan suhu anil antara sepasang primer 4 ℃ ~ 6 ℃ tidak akan mempengaruhi hasil PCR, tetapi idealnya suhu anil sepasang primer adalah sama, yang dapat bervariasi antara 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Hindari area struktur sekunder dari template amplifikasi
Yang terbaik adalah menghindari wilayah struktur sekunder dari templat saat memilih fragmen yang diperkuat.Struktur sekunder yang stabil dari fragmen target dapat diprediksi dan diestimasi oleh perangkat lunak komputer yang relevan, yang berguna untuk pemilihan template.Hasil eksperimen menunjukkan bahwa pemuaian seringkali tidak berhasil bila energi bebas (△G) daerah yang diekspansi kurang dari 58,6 lkJ/mol.
5. Ketidakcocokan dengan DNA target
Ketika urutan DNA target yang diamplifikasi besar, primer dapat berikatan dengan beberapa bagian DNA target, menghasilkan banyak pita yang muncul pada hasilnya.Kali ini perlu menggunakan pengujian perangkat lunak BLAST, situs web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Pilih Sejajarkan dua urutan (bl2seq).
Menempelkan sekuens primer ke zona 1 dan sekuens DNA target ke zona 2 dapat dipertukarkan, dan BLAST menghitung komplementer, antisense, dan kemungkinan lainnya, sehingga pengguna tidak perlu memperhatikan apakah kedua rantai tersebut adalah rantai indra.Anda juga dapat memasukkan nomor GI jika Anda mengetahui nomor GI dari urutan di database, sehingga Anda tidak perlu menempelkan bagian besar dari urutan tersebut.Terakhir, klik Align at 3 untuk melihat apakah primer memiliki beberapa situs homolog pada DNA target.
6. Terminal primer
Ujung 3 'dari primer adalah tempat ekstensi dimulai, jadi penting untuk mencegah ketidakcocokan dimulai dari sana.Ujung 3 'tidak boleh lebih dari 3 G atau C berturut-turut, karena ini akan menyebabkan primer terpicu secara keliru di wilayah urutan pengayaan G+C.Ujung 3' tidak dapat membentuk struktur sekunder apa pun, kecuali pada reaksi PCR (AS-PCR) khusus, ujung 3' primer tidak dapat tidak cocok.Misalnya, jika daerah pengkodean diamplifikasi, ujung 3 'primer tidak boleh diakhiri pada posisi ketiga kodon, karena posisi ketiga kodon cenderung mengalami degenerasi, yang akan mempengaruhi spesifisitas dan efisiensi amplifikasi.Saat menggunakan primer aneksasi, lihat tabel penggunaan kodon, perhatikan preferensi biologis, jangan gunakan primer aneksasi pada ujung 3′, dan gunakan konsentrasi primer yang lebih tinggi (1uM-3uM).
7. Struktur sekunder primer
Primer itu sendiri seharusnya tidak memiliki urutan komplementer, jika tidak primer itu sendiri akan terlipat menjadi struktur jepit rambut, dan struktur sekunder ini akan mempengaruhi pengikatan primer dan templat karena halangan sterik.Jika penilaian buatan digunakan, basis komplementer kontinyu dari primer itu sendiri tidak boleh lebih besar dari 3bp.Seharusnya tidak ada saling melengkapi antara kedua primer, terutama tumpang tindih komplementer ujung 3 'harus dihindari untuk mencegah pembentukan dimer primer.Secara umum, tidak boleh ada lebih dari 4 basa berurutan homologi atau komplementaritas antara sepasang primer.
8. Tambahkan penanda atau lokus
Ujung 5 'memiliki sedikit efek pada spesifisitas amplifikasi dan karenanya dapat dimodifikasi tanpa mempengaruhi spesifisitas amplifikasi.Modifikasi primer 5' end meliputi: penambahan sisi restriksi enzim;Biotin berlabel, fluoresensi, digoksin, Eu3+, dll. Memperkenalkan urutan DNA pengikat protein;Memperkenalkan situs mutasi, memasukkan dan menghilangkan sekuens mutasi dan memperkenalkan sekuens promotor, dll. Basa ekstra sedikit banyak akan mempengaruhi efisiensi amplifikasi dan meningkatkan kemungkinan pembentukan dimer primer, tetapi beberapa konsesi harus dibuat untuk langkah selanjutnya.Urutan tambahan yang tidak ada pada urutan target, seperti situs restriksi dan urutan promotor, dapat ditambahkan ke ujung 5' primer tanpa mempengaruhi spesifisitas.Urutan ini tidak termasuk dalam perhitungan nilai Tm primer, tetapi harus diuji untuk komplementaritas dan struktur sekunder internal.
9. Subklon
Sebagian besar waktu, PCR hanyalah kloning awal, dan kemudian kita perlu mensubkloning fragmen target ke berbagai vektor, jadi kita perlu merancang basis tambahan untuk operasi selanjutnya pada langkah PCR.
Beberapa urutan yang dirancang untuk subcloning dirangkum di bawah ini.
Situs restriksi endonuklease restriksi ditambahkan
Menambahkan situs restriksi enzim adalah metode yang paling umum digunakan untuk subkloning produk PCR.Umumnya, situs pembelahan adalah enam basis, selain 5 'ujung situs pembelahan perlu menambahkan 2 ~ 3 basis pelindung.Namun, jumlah basa pelindung yang dibutuhkan oleh enzim berbeda berbeda.Misalnya, SalⅠ tidak memerlukan alas pelindung, EcoRⅤ membutuhkan 1 alas pelindung, NotⅠ membutuhkan 2 alas pelindung, dan Hind Ⅲ membutuhkan 3 alas pelindung.
LIC menambahkan ekornya
Nama lengkap LIC adalah kloning Ligasi-Independen, metode kloning yang ditemukan oleh Navogen khusus untuk bagiannya dari vektor pet.Pembawa pet yang dibuat dengan metode LIC memiliki ujung lengket untai tunggal dasar 12-15 non-komplementer, yang melengkapi ujung lengket yang sesuai pada fragmen sisipan target.Untuk tujuan amplifikasi, urutan primer 5′ dari fragmen yang disisipkan harus melengkapi vektor LIC.Aktivitas ekstranek 3′→5′ dari DNA polimerase T4 dapat membentuk ujung lengket untai tunggal pada fragmen yang disisipkan setelah waktu yang singkat.Karena produk hanya dapat dibentuk dari saling anil dari fragmen sisipan yang disiapkan dan vektor, metode ini sangat cepat dan efisien, dan diarahkan kloning.
Klon TA diarahkan menambahkan ekor
Kloning TA tidak dapat menargetkan fragmen menjadi vektor, jadi kemudian Invitrogen memperkenalkan vektor yang dapat menargetkan kloning, yang berisi empat GTGGS dasar yang menonjol di salah satu ujungnya.Oleh karena itu, dalam desain primer PCR harus ditambahkan sekuens komplementer yang sesuai, sehingga fragmen dapat “berorientasi”.
Jika Anda kekurangan waktu, Anda dapat mencoba sintesis langsung, menggabungkan gen dengan vektor, yang kami sebut sintesis gen ET pada ahli otot.
D. Metode kloning In-Fusion
Tidak diperlukan ligase, tidak diperlukan reaksi panjang.Selama urutan pada kedua ujung vektor linier diperkenalkan Dalam desain primer, kemudian produk PCR dan vektor linier ditambahkan ke dalam larutan enzim in-fusion yang mengandung BSA dan ditempatkan pada suhu kamar selama setengah jam, transformasi dapat dilakukan.Metode ini sangat cocok untuk konversi volume besar.
10. Gabungkan primer
Kadang-kadang, hanya informasi urutan terbatas yang diketahui tentang desain primer.Misalnya, jika hanya sekuens asam amino yang diketahui, penggabungan primer dapat dirancang.Primer penggabungan adalah campuran dari sekuens berbeda yang mewakili semua kemungkinan basa berbeda yang menyandikan asam amino tunggal.Untuk meningkatkan spesifisitas, Anda dapat merujuk ke tabel penggunaan kodon untuk mengurangi aneksasi sesuai dengan preferensi penggunaan dasar dari berbagai organisme.Hypoxanthine dapat dipasangkan dengan semua basa untuk mengurangi suhu anil primer.Jangan gunakan basa yang dilampirkan pada ujung 3' primer karena anil dari 3 basa terakhir pada ujung 3' cukup untuk memulai PCR di tempat yang salah.Konsentrasi primer yang lebih tinggi (1μM hingga 3μM) digunakan karena primer dalam banyak campuran aneksasi tidak spesifik untuk template target.
bahan baku PCRkontrol
1. Kuantitas primer
Konsentrasi masing-masing primer adalah 0,1 ~ 1umol atau 10 ~ 100pmol.Lebih baik menghasilkan hasil yang dibutuhkan dengan jumlah primer yang paling sedikit.Konsentrasi primer yang tinggi akan menyebabkan mismatch dan amplifikasi nonspesifik, serta memperbesar kemungkinan terbentuknya dimer antar primer.
2. Konsentrasi primer
Konsentrasi primer mempengaruhi spesifisitas.Konsentrasi primer optimal umumnya antara 0,1 dan 0,5μM.Konsentrasi primer yang lebih tinggi menyebabkan amplifikasi produk nonspesifik.
3. Suhu anil primer
Parameter penting lainnya untuk primer adalah suhu leleh (Tm).Ini adalah suhu ketika 50% primer dan sekuens komplementer direpresentasikan sebagai molekul DNA beruntai ganda.Tm diperlukan untuk mengatur suhu anil PCR.Idealnya, suhu anil cukup rendah untuk memastikan anil primer yang efektif dengan urutan target, tetapi cukup tinggi untuk mengurangi pengikatan nonspesifik.Suhu anil yang wajar dari 55 ℃ hingga 70 ℃.Suhu anil umumnya diatur 5 ℃ lebih rendah dari Tm primer.
Ada beberapa formula untuk pengaturan Tm yang sangat bervariasi tergantung pada formula yang digunakan dan urutan primer.Karena sebagian besar rumus memberikan perkiraan nilai Tm, semua suhu anil hanyalah titik awal.Spesifisitas dapat ditingkatkan dengan menganalisis beberapa reaksi yang secara progresif menaikkan suhu annealing.Mulai di bawah perkiraan Tm-5℃, dan secara bertahap tingkatkan suhu anil dengan kenaikan 2℃.Suhu anil yang lebih tinggi akan mengurangi pembentukan dimer primer dan produk non-spesifik.Untuk hasil terbaik, kedua primer harus memiliki perkiraan nilai Tm.Jika perbedaan Tm pasangan primer lebih dari 5 ℃, primer akan menunjukkan start salah yang signifikan dengan menggunakan suhu anil yang lebih rendah dalam siklus.Jika kedua primer Tm berbeda, atur suhu anil menjadi 5℃ lebih rendah dari Tm terendah.Atau, untuk meningkatkan spesifisitas, lima siklus dapat dilakukan pertama pada suhu anil yang dirancang untuk Tm yang lebih tinggi, diikuti oleh siklus yang tersisa pada suhu anil yang dirancang untuk Tm yang lebih rendah.Ini memungkinkan salinan sebagian dari templat tujuan diperoleh dalam kondisi yang ketat.
4. Kemurnian dan stabilitas primer
Kemurnian standar primer khusus cukup untuk sebagian besar aplikasi PCR.Penghapusan gugus benzoil dan isobutilil dengan desalting minimal dan karenanya tidak mengganggu PCR.Beberapa aplikasi memerlukan pemurnian untuk menghapus urutan non-panjang penuh dalam proses sintesis.Urutan terpotong ini terjadi karena efisiensi kimia sintesis DNA tidak 100%.Ini adalah proses melingkar yang menggunakan reaksi kimia berulang karena setiap basa ditambahkan untuk membuat DNA dari 3′ menjadi 5′.Anda bisa gagal di salah satu siklus.Primer yang lebih panjang, terutama yang lebih besar dari 50 basa, memiliki sebagian besar urutan terpotong dan mungkin memerlukan pemurnian.
Hasil primer dipengaruhi oleh efisiensi kimia sintetik dan metode pemurnian.Perusahaan biofarmasi, seperti Sitologi dan Shengong, semuanya menggunakan unit OD minimum untuk memastikan output total oligonukleosida.Primer khusus dikirim dalam bentuk bubuk kering.Yang terbaik adalah melarutkan kembali primer dalam TE sehingga konsentrasi akhir adalah 100μM.TE lebih baik daripada air deionisasi karena pH air seringkali bersifat asam dan akan menyebabkan hidrolisis oligonukleosida.
Stabilitas primer tergantung pada kondisi penyimpanan.Serbuk kering dan primer terlarut harus disimpan pada suhu -20℃.Primer yang dilarutkan dalam TE pada konsentrasi lebih besar dari 10μM dapat disimpan secara stabil pada suhu -20℃ selama 6 bulan, tetapi hanya dapat disimpan pada suhu kamar (15℃ hingga 30℃) selama kurang dari 1 minggu.Primer bubuk kering dapat disimpan pada suhu -20 C selama minimal 1 tahun dan pada suhu kamar (15 C hingga 30 C) hingga 2 bulan.
5. Enzim dan konsentrasinya
Saat ini, Taq DNA polimerase yang digunakan pada dasarnya adalah enzim rekayasa gen yang disintesis oleh bakteri koliform.Jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mengkatalisasi reaksi PCR tipikal adalah sekitar 2,5U (mengacu pada total volume reaksi 100ul).Jika konsentrasinya terlalu tinggi, dapat menyebabkan amplifikasi non-spesifik;jika konsentrasinya terlalu rendah, jumlah produk sintetik akan berkurang.
6. Kualitas dan konsentrasi dNTP
Kualitas dNTP terkait erat dengan konsentrasi dan efisiensi amplifikasi PCR.Serbuk dNTP berbentuk butiran, dan variabilitasnya kehilangan aktivitas biologisnya jika disimpan dengan tidak benar.Larutan dNTP bersifat asam, dan harus digunakan dalam konsentrasi tinggi, dengan larutan buffer 1M NaOH atau 1M Tris.HCL untuk menyesuaikan PH-nya menjadi 7,0 ~ 7,5, sejumlah kecil sub-kemasan, penyimpanan beku pada -20℃.Beberapa pencairan beku akan menurunkan dNTP.Dalam reaksi PCR, dNTP harus 50 ~ 200umol/L.Terutama, perhatian harus diberikan pada konsentrasi keempat DNTPS harus sama (preparasi mol yang sama).Jika konsentrasi salah satu dari mereka berbeda dari yang lain (lebih tinggi atau lebih rendah), ketidaksesuaian akan terjadi.Konsentrasi yang terlalu rendah akan menurunkan rendemen produk PCR.dNTP dapat bergabung dengan Mg2+ dan mengurangi konsentrasi Mg2+ bebas.
7. Templat (gen target) asam nukleat
Jumlah dan tingkat pemurnian asam nukleat template adalah salah satu kunci untuk keberhasilan atau kegagalan PCR.Metode pemurnian DNA tradisional biasanya menggunakan SDS dan protease K untuk mencerna dan membuang spesimen.Fungsi utama SDS adalah: melarutkan lipid dan protein pada membran sel, sehingga menghancurkan membran sel dengan melarutkan protein membran, dan memisahkan protein nuklir di dalam sel, SDS juga dapat bergabung dengan protein dan mengendap;Protease K dapat menghidrolisis dan mencerna protein, terutama histon yang terikat dengan DNA, kemudian menggunakan fenol dan kloroform pelarut organik untuk mengekstrak protein dan komponen sel lainnya, dan menggunakan etanol atau isopropil alkohol untuk mengendapkan asam nukleat.Asam nukleat yang diekstraksi dapat digunakan sebagai templat untuk reaksi PCR.Untuk spesimen deteksi klinis umum, metode cepat dan sederhana dapat digunakan untuk melarutkan sel, menglisat patogen, mencerna dan menghilangkan protein dari kromosom untuk membebaskan gen target, dan langsung digunakan untuk amplifikasi PCR.Ekstraksi template RNA biasanya menggunakan metode guanidine isothiocyanate atau protease K untuk mencegah RNase mendegradasi RNA.
8.Mg2+ konsentrasi
Mg2+ memiliki pengaruh yang signifikan terhadap spesifisitas dan hasil amplifikasi PCR.Pada reaksi PCR umum, ketika konsentrasi berbagai dNTP adalah 200umol/L, konsentrasi Mg2+ yang sesuai adalah 1,5 ~ 2,0mmol/L.Konsentrasi Mg2+ terlalu tinggi, spesifisitas reaksi menurun, terjadi amplifikasi non-spesifik, konsentrasi terlalu rendah akan menurunkan aktivitas Taq DNA polimerase, sehingga terjadi reduksi produk reaksi.
Ion magnesium mempengaruhi beberapa aspek PCR, seperti aktivitas DNA polimerase, yang mempengaruhi hasil;Contoh lain adalah anil primer, yang memengaruhi spesifisitas.dNTP dan templat berikatan dengan ion magnesium, mengurangi jumlah ion magnesium bebas yang diperlukan untuk aktivitas enzim.Konsentrasi ion magnesium yang optimal bervariasi untuk pasangan primer dan templat yang berbeda, tetapi konsentrasi awal PCR tipikal dengan 200μM dNTP adalah 1,5mM (catatan: Untuk PCR kuantitatif waktu nyata, gunakan larutan ion magnesium 3 hingga 5mM dengan probe fluoresen).Konsentrasi ion magnesium bebas yang lebih tinggi meningkatkan hasil, tetapi juga meningkatkan amplifikasi nonspesifik dan menurunkan kesetiaan.Untuk menentukan konsentrasi optimal, titrasi ion magnesium dilakukan dengan penambahan 0,5mM dari 1mM ke 3mM.Untuk mengurangi ketergantungan pada optimasi ion magnesium, Platinum Taq DNA polimerase dapat digunakan.Platinum Taq DNA polimerase mampu mempertahankan fungsi pada kisaran konsentrasi ion magnesium yang lebih luas daripada Taq DNA polimerase dan oleh karena itu membutuhkan lebih sedikit pengoptimalan.
9. Aditif yang mempromosikan PCr
Optimalisasi suhu anil, desain primer, dan konsentrasi ion magnesium cukup untuk amplifikasi yang sangat spesifik dari sebagian besar templat;namun, beberapa template, termasuk template dengan konten GC tinggi, memerlukan tindakan tambahan.Aditif yang memengaruhi suhu leleh DNA menyediakan cara lain untuk meningkatkan spesifisitas dan hasil produk.Denaturasi penuh dari template diperlukan untuk hasil terbaik.
Selain itu, struktur sekunder mencegah pengikatan primer dan ekstensi enzim.
Aditif PCR, termasuk formamida, DMSO, gliserin, betaine, dan PCRx Enhancer Solution, meningkatkan amplifikasi.Mekanisme mereka yang mungkin adalah untuk mengurangi suhu leleh, sehingga membantu anil primer dan membantu ekstensi polimerase DNA melalui wilayah struktur sekunder.Solusi PCRx memiliki keunggulan lain.Pengoptimalan ion magnesium minimal diperlukan saat digunakan dengan Platinum Taq DNA polimerase dan Platinum Pfx DNA polimerase.Dengan demikian, teknik Platinum dikombinasikan dengan aditif untuk meningkatkan spesifisitas sekaligus mengurangi ketergantungan pendekatan ketiga, optimalisasi ion magnesium.Untuk hasil terbaik, konsentrasi aditif harus dioptimalkan, khususnya DMSO, formamida, dan gliserol, yang menghambat Taq DNA polimerase.
10. Awal yang panas
Hot start PCR adalah salah satu metode terpenting untuk meningkatkan spesifisitas PCR selain desain primer yang baik.Meskipun suhu pemanjangan optimal Taq DNA polimerase adalah 72℃, polimerase tetap aktif pada suhu kamar.Dengan demikian, produk non-spesifik dihasilkan ketika suhu penahan lebih rendah dari suhu anil selama persiapan reaksi PCR dan pada awal siklus termal.Setelah terbentuk, produk nonspesifik ini diperkuat secara efektif.Hot-start PCR sangat efektif ketika situs yang digunakan untuk desain primer dibatasi oleh lokasi elemen genetik, seperti mutasi yang diarahkan situs, kloning ekspresi, atau konstruksi dan manipulasi elemen genetik yang digunakan untuk rekayasa DNA.
Metode umum untuk membatasi aktivitas Taq DNA polimerase adalah menyiapkan larutan reaksi PCR di atas es dan menempatkannya di alat PCR yang telah dipanaskan sebelumnya.Metode ini sederhana dan murah, tetapi tidak menyelesaikan aktivitas enzim dan karenanya tidak sepenuhnya menghilangkan amplifikasi produk nonspesifik.
Priming termal menunda sintesis DNA dengan menghambat komponen penting sampai peralatan PCR mencapai suhu denaturasi.Sebagian besar metode inisiasi termal manual, termasuk penambahan Taq DNA polimerase yang tertunda, tidak praktis, terutama untuk aplikasi throughput tinggi.Metode priming termal lainnya menggunakan pelindung lilin untuk membungkus komponen penting, termasuk ion magnesium atau enzim, atau untuk mengisolasi komponen reaktif secara fisik, seperti template dan buffer.Selama siklus termal, berbagai komponen dilepaskan dan dicampur bersama saat lilin meleleh.Seperti metode hot start manual, metode wax shield rumit dan rentan terhadap kontaminasi serta tidak cocok untuk aplikasi throughput tinggi.
Platinum DNA polimerase nyaman dan efisien untuk PCR mulai panas otomatis.Platinum Taq DNA polimerase terdiri dari rekombinan Taq DNA polimerase yang dikombinasikan dengan antibodi monoklonal terhadap Taq DNA polimerase.Antibodi diformulasikan oleh PCR untuk menghambat aktivitas enzim selama penahanan suhu yang lama.Taq DNA polimerase dilepaskan ke dalam reaksi selama isolasi 94 ℃ dari langkah denaturasi, memulihkan aktivitas polimerase penuh.Berbeda dengan Taq DNA polimerase yang dimodifikasi secara kimiawi untuk inisiasi termal, enzim Platinum tidak memerlukan insulasi berkepanjangan pada suhu 94℃ (10 hingga 15 menit) untuk mengaktifkan polimerase.Dengan PlatinumTaq DNA polimerase, 90% aktivitas Taq DNA polimerase dipulihkan setelah 2 menit pada suhu 94℃.
11. Sarang-PCR
Putaran amplifikasi berturut-turut menggunakan primer bersarang dapat meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas.Putaran pertama adalah amplifikasi standar 15 sampai 20 siklus.Sebagian kecil dari produk amplifikasi awal diencerkan 100 sampai 1000 kali dan ditambahkan ke putaran kedua amplifikasi selama 15 sampai 20 siklus.Secara alternatif, produk amplifikasi awal dapat diukur dengan pemurnian gel.Primer bersarang digunakan pada amplifikasi putaran kedua, yang dapat mengikat urutan target di dalam primer pertama.Penggunaan PCR bersarang mengurangi kemungkinan amplifikasi beberapa situs target karena hanya ada sedikit urutan target yang melengkapi kedua set primer.Jumlah total siklus yang sama (30 hingga 40) dengan primer yang sama memperkuat situs nonspesifik.Nested PCR meningkatkan sensitivitas sekuens target terbatas (misalnya mrna yang jarang) dan meningkatkan spesifisitas PCRS yang sulit (misalnya 5′ RACE).
12. PCR menurun
Descending PCR meningkatkan spesifisitas dengan menggunakan kondisi anil ketat untuk beberapa siklus pertama PCR.Siklus dimulai pada suhu anil kira-kira 5℃ lebih tinggi dari perkiraan Tm, kemudian setiap siklus dikurangi 1℃ menjadi 2℃ sampai suhu anil di bawah Tm 5℃.Hanya templat tujuan dengan homologi tertinggi yang akan diamplifikasi.Produk-produk ini terus berkembang dalam siklus-siklus berikutnya, menggantikan produk-produk nonspesifik yang diperkuat.Descending PCR berguna untuk metode di mana tingkat homologi antara primer dan target template tidak diketahui, seperti sidik jari DNA AFLP.
Kit PCR Terkait
Pahlawan 2x PCRTMSistem campuran memiliki toleransi yang lebih tinggi terhadap penghambat PCR daripada sistem Campuran PCR biasa, dan dapat dengan mudah mengatasi amplifikasi PCR dari berbagai templat kompleks.Sistem reaksi yang unik dan efisiensi tinggi Taq Hero membuat reaksi PCR memiliki efisiensi amplifikasi, spesifisitas, dan sensitivitas yang lebih tinggi.
Efisiensi amplifikasi lebih tinggi
Ia memiliki aktivitas DNA polimerase 5'→3' dan aktivitas eksonuklease 5'→3', tanpa aktivitas eksonuklease 3'→5'.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Spesifik — buffer yang dioptimalkan dan enzim Taq hot-start dapat mencegah amplifikasi non-spesifik dan pembentukan dimer primer
Sensitivitas tinggi—dapat mendeteksi salinan template yang rendah
Kit ini menggunakan reagen transkripsi terbalik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase yang dikombinasikan dengan sistem reaksi unik untuk secara efektif meningkatkan efisiensi amplifikasi dan spesifisitas reaksi.
Waktu posting: Mei-09-2023
