Semua orang berbicara tentang prinsip eksperimen qRT-PCR, desain primer, interpretasi hasil, dll., tetapi saya pikir saya harus berbagi dengan Anda operasi eksperimental qRT-PCR.Ini kecil, tapi ini tentang hasil.
Sebelum melakukan qRT-PCR, kita perlu memiliki pemahaman yang jelas tentang RNA dan metode operasi kita sendiri.Bagaimanapun, upaya kami ditujukan untuk mendapatkan hasil, bukan sekadar berlatih.Jadi sebelum melakukan qRT-PCR, kita perlu menentukan isu-isu berikut (beberapa di antaranya hanya berlaku untuk SYBR).
1 Apakah Anda yakin RNA Anda tidak terdegradasi?
NanoDrop 2000 hanya dapat mendeteksi konsentrasi dan kemurnian RNA, tetapi tidak dapat mendeteksi integritas RNA.
Nilai RNA (RNA Intesity Number) dapat mencerminkan integritas RNA yang dideteksi oleh sistem Agilent 2100 Bioanalyzer.
Gambar Diagram skematik nilai RIN untuk sampel RNA yang berbeda (eukariota)
Namun, laboratorium umumnya tidak memiliki Agilent 2100 Bioanalyzer.Dalam hal ini, kami dapat mendeteksi melalui gel formaldehida, tetapi persyaratan jumlah total RNA tinggi, sehingga metode tercepat adalah menggunakan elektroforesis gel biasa.Hal ini diperlukan untuk berada di lingkungan bebas nuclease, sehingga tangki elektroforesis, botol sol, braket gel dan sisir perlu dibilas dengan air DEPC.Agarosa juga bebas nuklease (selama baru dibuka), dan Loading Buffer harus dibuka sebanyak mungkin, dengan 1,2% gel.
Perhatikan bahwa gel harus benar-benar larut, jika tidak maka akan menyebabkan pita yang tidak homogen, seperti yang ditunjukkan pada sampel 9 pada gambar.Jika voltase terlalu tinggi atau berjalan terlalu lama akan menghasilkan panas dan menyebabkan degradasi RNA, sehingga voltase dan waktu harus dikontrol secara wajar.Selain itu, gel running juga dapat menentukan lebih lanjut apakah ada residu DNA dalam sampel, dan mengamati apakah ada sejumlah besar pita yang tertahan di sumur pengeluaran.
Angka.Deteksi elektroforesis gel RNA
2 Apakah Anda yakin tentang konsentrasi cDNA Anda?
Pengalaman kakak-kakak di laboratorium, cDNA sistem 20 ul yang didapat tiap inversi langsung diencerkan 20X, sedangkan kakak pasca-doktoral diencerkan 10X.Saya biasanya bergantung pada situasi.Karena kualitas RNA yang disebutkan oleh setiap orang berbeda, tingkat pembalikannya juga berbeda, dan teknologi pembalikannya mungkin tidak stabil.
Jadi setiap kali saya mendapatkan cDNA terbalik, pertama-tama saya akan mengencerkannya sekitar 3 kali, dan kemudian menggunakan gen rumah tangga untuk melakukan RT-PCR, jumlah siklus umumnya 25 siklus, untuk mengidentifikasi konsentrasi spesifik, dan kemudian menentukan faktor pengenceran akhir.
3 Apakah Anda yakin primer Anda mudah digunakan?
Itu bisa melewati kurva leleh qRT-PCR, tetapi ini masih membutuhkan biaya.Untuk laboratorium yang tidak memiliki banyak uang, ketika mendapatkan banyak primer, mereka dapat menggunakan RT-PCR biasa untuk melihat apakah itu pita tunggal dan mengidentifikasi spesifisitas primer tersebut.Jika laboratorium tidak kekurangan uang, spesifisitas semua primer dapat diidentifikasi sekali melalui kurva leleh.
4 Apakah Anda yakin bahwa kondisi eksperimen Anda cocok?
SYBR harus dilindungi dari cahaya yang kuat, jadi coba matikan lampu overhead saat menambahkan reagen SYBR, dan hanya perlu menggunakan lampu redup untuk menyelesaikannya.
Simpan SYBR pada suhu 4°C.Saat digunakan, balikkan perlahan ke atas dan ke bawah agar tercampur rata agar tidak berbusa, dan jangan divortex dengan kuat.
Beberapa adik perempuan suka menggambar tanda di papan PCR karena takut mencampur sampel, itu salah.Karena penanda Anda sangat mungkin memengaruhi pengumpulan sinyal fluoresen, saya biasanya merekomendasikan junior untuk menggunakan notebook eksperimental untuk membantu memori, seperti yang ditunjukkan di bawah ini.
Angka.diagram pemuatan sampel qRT-PCR
5 Apakah Anda yakin melakukannya dengan benar?
Pastikan memakai sarung tangan, pakai sarung tangan, pakai sarung tangan, dan ucapkan hal-hal penting tiga kali.
Untuk mengurangi eksposur SYBR ke cahaya, saya pribadi ingin menambahkan template terlebih dahulu, seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah ini.Berdasarkan pengalaman, penambahan template dalam jumlah sedikit kemungkinan akan menyebabkan kesalahan sampling.Oleh karena itu, untuk meminimalkan kesalahan yang disebabkan oleh penambahan sedikit template, saya biasanya menggandakan sampel lagi, dan menggandakan jumlahnya saat menambahkan sampel untuk mengurangi jumlah H2O2 yang ditambahkan.
Angka.Diagram skematik pemuatan qRT-PCR
Kemudian konfigurasikan sistem qRT-PCR sebagai berikut.
Angka.diagram persiapan sistem qRT-PCR
CATATAN: Proses konfigurasi perlu dilakukan di atas es.
Setelah menambahkan sampel, rekatkan film penyegel transparan.Usahakan untuk tidak menyentuh permukaan film penyegel transparan dengan tangan Anda, cukup operasikan dari ruang di kedua sisi film.Karena sidik jari juga dapat mempengaruhi pengumpulan sinyal neon.Kemudian gunakan centrifuge untuk melakukan centrifuge dengan cepat selama 10 detik dengan kecepatan rendah untuk mencegah sampel menggantung di dinding.
Produk-produk terkait:
Waktu posting: Apr-28-2023
