RT-qPCR adalah eksperimen dasar biologi molekuler, dan semua orang pasti sudah familiar dengannya.Ini terutama mencakup tiga langkah: ekstraksi RNA, transkripsi balik menjadi cDNA, dan PCR kuantitatif fluoresen waktu-nyata.Itu tidak membantu, apa yang terjadi?Kemungkinan ada masalah denganpercobaan transkripsi terbalik!Meskipun tampaknya percobaan transkripsi balik hanya perlu menambahkan RNA, dNTP, primer, danmembalikkan transkriptaseke tabung centrifuge dan campur dengan baik, tetapi dalam proses operasi yang sebenarnya, masih banyak detail yang perlu diperhatikan.Mari belajar tentang itu!

Bagaimana menilai kualitas RNA?
Untuk mendapatkan cDNA, kualitas RNA sangat penting!Kualitas RNA dapat dideteksi terutama dari dua aspek:
(1) Integritas RNA:Integritas RNA dapat diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa. Mengambil eukariota sebagai contoh, RNA total lengkap memiliki tiga pita yang jelas, berat molekul dari besar ke kecil adalah 28S, 18S, dan 5S, dan 28S dua kali lebih terang dari 18S;jika tiga pita dapat dilihat, tetapi jenis pita kabur atau Difusi berarti RNA sebagian terdegradasi.Saat ini, harap segera lakukan reaksi transkripsi balik dan tingkatkan input template dengan tepat;jika hanya pita dengan berat molekul kecil atau tidak ada pita yang terlihat, RNA telah terdegradasi sempurna dan perlu diekstraksi ulang .Agilent 2100 menunjukkan integritas RNA dengan diagram puncak dan nilai RIN.Jika asam nukleat utuh, garis dasar elektropherogram rata;jika asam nukleat sangat terdegradasi, baseline tidak merata dan puncak degradasi lebih banyak muncul;nilai RIN mencerminkan keutuhan RNA, dalam rentang 0-10, semakin besar nilainya, semakin baik kualitas RNA.Nah, semakin tinggi tingkat kelengkapannya.
(2) Kemurnian RNA:Rasio OD260/280 dapat dideteksi dengan spektrofotometri UV.Jika rasio OD260/280 antara 1,9 dan 2,1, kemurniannya sangat baik.
DNA genom residual dapat menyebabkan hasil kuantitatif yang tidak akurat
Saat RNA diekstrak, RNA yang kita dapatkan mungkin bercampur dengan genomic DNA (gDNA) yang belum dibersihkan.Oleh karena itu, cDNA setelah transkripsi balik juga akan bercampurgDNA.Selama di hilirqPCRreaksi,cDNAdan gDNA dapat diamplifikasi secara bersamaan, menghasilkan nilai CT yang relatif kecil, sehingga hasilnya mungkin bias.
Jadi apa yang harus kita lakukan dalam situasi ini?Foregenemenyarankan:
(1) Lakukan pembersihan genom pada RNA terbalik, yang dapat dihilangkan dengan ekstraksi kolom selama ekstraksi RNA;
(2) Perlakukan RNA yang diekstraksi dengan DNaseI , tetapi akhiri dengan EDTA;
reagen transkripsi balikdengan modul pembersihan genom;

Bagaimana cara memilih primer untuk transkripsi balik?
Primer transkripsi balik juga memengaruhi hasil reaksi transkripsi balik.Anda dapat memilih primer acak, Oligo dT, atau primer khusus gen untuk transkripsi terbalik sesuai dengan keadaan spesifik percobaan:
(1) Transkrip khusus: primer spesifik gen direkomendasikan;
(2) Transkrip fragmen panjang: Primer Oligo dT/gen-spesifik direkomendasikan;
(3) Fragmen internal transkrip segmen panjang: primer spesifik gen/ primer acak / primer acak + Oligo dT.Jika percobaan qPCR berikutnya dilakukan, Oligo dT tidak dapat digunakan sendiri, karena hanya menggunakan Oligo dT dapat menyebabkan bias ujung 3′, yang menyebabkan hasil percobaan qPCR tidak akurat;
(4) miRNA: Primer loop batang atau primer tailing dapat digunakan.

Berapa kali cDNA produk transkripsi terbalik harus diencerkan untuk kuantifikasi?
Setelah mendapatkan cDNA dari produk transkripsi balik, berapa kali cDNA harus diencerkan untuk percobaan qPCR sangat penting.Jika konsentrasi cDNA terlalu tinggi atau terlalu rendah, efisiensi amplifikasi dapat terpengaruh.Bisakah konsentrasi cDNA diukur, dan bagaimana cara melakukannya?
(1) Konsentrasi cDNA dari produk transkripsi balik tidak dapat diukur, karena selain produk cDNA, produk transkripsi balik juga mengandung Buffer residu transkripsi balik, transkriptase balik, primer, dll., yang akan mengganggu hasil pengukuran konsentrasi dan menyebabkan rasio OD260/280, OD260/230 abnormal dan karenanya tidak mencerminkan hasil cDNA yang sebenarnya.Saat ini, beberapa teman akan berkata, maka saya akan mengukur konsentrasi setelah pemurnian;disini,Foregene ingin mengingatkan bahwa cDNA tidak disarankan untuk dimurnikan, karena panjang cDNA yang diperoleh dengan pembalikan berbeda, dan cDNA pendek akan hilang dalam pemurnian.
(2) Jadi apa yang harus dilakukan?Sebelum percobaan qPCR, gradien pengenceran cDNA dapat ditentukan melalui pra-percobaan .Misalnya: gunakan larutan stok cDNA, pengenceran 10 kali lipat, dan pengenceran 100 kali lipat sebagai templat untuk percobaan qPCR, dan pilih faktor pengenceran dengan nilai CT dalam kisaran 18-28.

Bagaimana seharusnya miRNA ditranskripsi terbalik?
miRNA adalah RNA molekul kecil beruntai tunggal dengan ukuran sekitar 22 nt yang tidak mengkode protein.Karena panjangnya yang pendek, metode qPCR konvensional sulit untuk mengukurnya secara langsung, sehingga seringkali diperlukan untuk memperluas miRNA;metode transkripsi terbalik yang umum digunakan untuk miRNA termasuk metode stem-loop dan metode tailing.
Metode stem-loop adalah memperluas miRNA dengan menambahkan primer stem-loop.Metode deteksi ini memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang lebih tinggi, tetapi throughput deteksinya rendah.Satu transkripsi terbalik hanya dapat mendeteksi satu miRNA dan referensi internal;metode penambahan ekor terdiri dari dua. Ini dilengkapi dengan aksi gabungan dari dua enzim, yaitu PolyA polimerase dan reverse transcriptase.PolyA polimerase bertanggung jawab untuk menambahkan ekor PolyA ke miRNA untuk menambah panjangnya, dan reverse transcriptase melakukan reaksi transkripsi terbalik.Metode ini memiliki throughput deteksi yang tinggi dan dapat mendeteksi beberapa miRNA dan referensi internal dalam satu transkripsi balik, tetapi sensitivitas dan spesifisitasnya rendah pada metode stem-loop.