PCR Waktu Nyata, juga dikenal sebagai PCR kuantitatif atau qPCR, adalah metode pemantauan dan analisis produk amplifikasi PCR secara waktu nyata.
Karena PCR kuantitatif memiliki keunggulan operasi sederhana, cepat dan nyaman, sensitivitas tinggi, pengulangan yang baik, dan tingkat kontaminasi yang rendah, ini banyak digunakan dalam pengujian medis, penilaian kemanjuran obat, penelitian ekspresi gen, penelitian transgenik, deteksi gen, deteksi patogen, deteksi hewan dan tumbuhan., pengujian makanan dan bidang lainnya.
Oleh karena itu, apakah Anda terlibat dalam penelitian dasar dalam ilmu hayati, atau karyawan perusahaan farmasi, perusahaan peternakan, perusahaan makanan, atau bahkan karyawan biro inspeksi dan karantina, departemen pemantauan lingkungan, rumah sakit, dan unit lainnya, Anda akan lebih atau kurang terpapar. Atau Anda perlu mengetahui pengetahuan menguasai PCR kuantitatif.

Prinsip PCR Waktu Nyata

PCR Waktu Nyata adalah metode di mana zat fluoresen ditambahkan ke sistem reaksi PCR, dan intensitas sinyal fluoresensi dalam proses reaksi PCR dipantau secara waktu nyata oleh instrumen PCR kuantitatif, dan akhirnya data eksperimen dianalisis dan diproses.

【Kurva amplifikasi】adalah kurva yang menggambarkan proses dinamis PCR.Kurva amplifikasi PCR sebenarnya bukan kurva eksponensial standar, tetapi kurva sigmoid.

[Fase platform kurva amplifikasi]Dengan bertambahnya jumlah siklus PCR, inaktivasi DNA polimerase, penipisan dNTP dan primer, dan penghambatan reaksi sintesis oleh reaksi produk samping pirofosfat, dll., PCR tidak selalu berkembang secara eksponensial., dan pada akhirnya akan memasuki dataran tinggi.

[Wilayah Pertumbuhan Eksponensial Kurva Amplifikasi]Meskipun fase dataran tinggi sangat bervariasi, di wilayah tertentu dari wilayah pertumbuhan eksponensial kurva amplifikasi, pengulangannya sangat baik, yang sangat penting untuk analisis kuantitatif PCR.

[Nilai ambang batas dan nilai Ct]Kami menetapkan nilai batas deteksi fluoresensi pada posisi yang sesuai di area pertumbuhan eksponensial kurva amplifikasi, yaitu nilai ambang batas (Threshold).Perpotongan nilai threshold dan kurva amplifikasi adalah nilai Ct, yaitu nilai Ct mengacu pada jumlah siklus (Threshold Cycle) pada saat nilai threshold tercapai.

Grafik di bawah ini dengan jelas menunjukkan hubungan antara garis threshold dan kurva amplifikasi, threshold dan nilai Ct.

【Bagaimana cara mengukur?】

Telah dibuktikan dengan teori matematika bahwa nilai Ct memiliki hubungan linier terbalik dengan logaritma jumlah template awal.Real Time PCR memantau produk amplifikasi PCR secara real time dan menghitungnya selama fase amplifikasi eksponensial.

Untuk setiap siklus PCR, DNA meningkat secara eksponensial sebanyak 2 kali lipat, dan segera mencapai puncaknya.

Asumsikan bahwa jumlah DNA awal adalah A₀ , setelah n siklus, jumlah teoritis produk DNA dapat dinyatakan sebagai:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Kemudian, semakin banyak jumlah DNA awal A 0, semakin cepat jumlah produk yang diperkuat mencapai nilai deteksi An , dan jumlah siklus saat mencapai An adalah nilai Ct.Artinya, semakin banyak jumlah DNA awal A 0, semakin awal puncak kurva amplifikasi, dan jumlah siklus n yang diperlukan semakin kecil.

Kami melakukan pengenceran gradien dari standar konsentrasi yang diketahui dan menggunakannya sebagai templat untuk PCR Waktu Nyata, dan serangkaian kurva amplifikasi akan diperoleh pada interval yang sama dalam urutan jumlah DNA awal dari lebih banyak ke lebih sedikit.Menurut hubungan linier antara nilai Ct dan logaritma jumlah templat awal, a[kurva standar] dapat dibuat.

Dengan mensubstitusi nilai Ct dari sampel dengan konsentrasi yang tidak diketahui ke dalam kurva standar, jumlah template awal dari sampel dengan konsentrasi yang tidak diketahui dapat diperoleh, yang merupakan prinsip kuantitatif Real Time PCR.

Metode deteksi Real Time PCR

Real Time PCR mendeteksi produk amplifikasi PCR dengan mendeteksi intensitas fluoresensi dalam sistem reaksi.

Prinsip Metode Penyematan Fluorescent Dye】

Pewarna fluoresen, seperti TB Green ® , dapat secara nonspesifik berikatan dengan DNA beruntai ganda dalam sistem PCR dan berpendar saat berikatan.

Intensitas fluoresensi dalam sistem reaksi meningkat secara eksponensial dengan peningkatan siklus PCR.Dengan mendeteksi intensitas fluoresensi, jumlah amplifikasi DNA dalam sistem reaksi dapat dipantau secara waktu nyata, dan kemudian jumlah templat awal dalam sampel dapat diperkirakan secara terbalik.

【Prinsip metode probe fluoresen】

probe neonadalah sekuens asam nukleat dengan gugus fluoresen pada ujung 5′ dan gugus quenching pada ujung 3′, yang secara khusus dapat berikatan dengan templat.Ketika probe utuh, fluoresensi yang dipancarkan oleh fluorofor dipadamkan oleh kelompok quenching dan tidak dapat berfluoresensi.Ketika probe terurai, zat fluoresen akan berdisosiasi dan memancarkan fluoresensi.

Probe fluoresen ditambahkan ke larutan reaksi PCR.Selama proses anil, probe fluoresen akan mengikat ke posisi spesifik template.Selama proses ekstensi, aktivitas eksonuklease 5′→3′ dari enzim PCR dapat menguraikan probe fluoresen yang dihibridisasi dengan templat, dan zat fluoresen dipisahkan untuk memancarkan fluoresensi.Dengan mendeteksi intensitas fluoresensi probe dalam sistem reaksi, tujuan pemantauan jumlah amplifikasi produk PCR dapat tercapai.

【Pemilihan Metode Deteksi Fluoresensi】

Jika digunakan untuk membedakan sekuens dengan homologi tinggi dan melakukan deteksi PCR multipleks seperti analisis pengetikan SNP, metode probe fluoresen tidak tergantikan.
Untuk eksperimen PCR Waktu Nyata lainnya, metode chimera fluoresen yang sederhana, mudah, dan murah dapat digunakan.

probe Spesifisitas yang kuat, mampu PCR multipleks

Kekurangan

Persyaratan spesifisitas tinggi untuk amplifikasi;

PCR multipleks tidak dapat dilakukan Perlu merancang probe khusus, biaya tinggi;

terkadang desain probe sulit

Produk-produk terkait: