RNase adalah kata sensitif yang tidak ingin didengar oleh banyak siswa yang sering melakukan eksperimen ekstraksi RNA.Bersenjata penuh, RNA yang akhirnya diekstraksi dengan reagen fenol dan kloroform yang sangat beracun terdegradasi.Saya tidak berdamai!!!Hari ini, mari kita lihat asal usul Rnase yang terkenal itu.

Ribonuclease (RNase), atau RNase, adalah nuklease yang dapat menghidrolisis RNA menjadi molekul kecil.RNase, sebagai protein molekul kecil, sangat stabil .Sterilisasi uap suhu tinggi dan tekanan tinggi konvensional serta penghambat protein tidak dapat sepenuhnya menonaktifkannya.Stabilitas RNase terutama berasal dari ikatan disulfida dalam struktur.Misalnya, RNase pankreas sapi yang umum digunakan hanya memiliki 124 asam amino, tetapi mengandung 4 ikatan disulfida.Ikatan belerang dan ikatan disulfida memberikan RNase dengan stabilitas termal yang sangat baik.Selain itu, rnase memiliki berat molekul yang relatif kecil dan dapat dengan cepat mengembalikan konformasi aslinya dalam banyak kasus.

Selain sangat stabil,RNases ada di mana-mana di laboratorium .RNase adalah mekanisme pertahanan biologis.Untuk sebuah sel, RNA eksogen seringkali berakibat fatal.Dibandingkan dengan DNA eksogen, RNA eksogen seringkali lebih berbahaya.RNA dengan senang hati ditranskripsi dan diterjemahkan, sehingga hampir semua organisme telah mengembangkan RNase untuk mempertahankan diri dari invasi RNA eksogen.Oleh karena itu, sel bakteri yang dibudidayakan di laboratorium dan Anda yang mengekstraksi RNA memancarkan aroma RNase.Cairan tubuh manusia (air liur, air mata, dll.) mengandung RNase dalam jumlah besar, jadi jangan menangis saat RNA terdegradasi.Semakin banyak Anda menangis, semakin buruk degradasi RNA!!Saudari Daiyu tidak cocok untuk ekstraksi RNA!

Selain itu, kulit halus Anda juga banyak mengandung RNase, dan spidol, pipet, pintu lemari es, dan gagang pintu yang telah tersentuh kulit juga mengandung RNase.

Dengan banyaknya ocehan, mari kita lihat bagaimana menangani RNases.

Hal pertama yang dipikirkan semua orang saat melepas RNA adalahDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC terutama mendenaturasi protein dengan bergabung dengan cincin imidazol dari histidin kelompok aktif RNase, sehingga menghambat aktivitas enzim.0,1% DEPC dapat memberikan efek penghilangan Rnase yang lebih baik, tetapi kita perlu memperhatikan bahwa DEPC dikenal sebagai karsinogen, jadi perhatian khusus harus diberikan saat menggunakannya.

Untuk RNase, kita perlu memulai dari dua aspek,yang pertama adalah menghambat aktivitas RNase endogen

Reagen ekstraksi RNA konvensional seperti guanidine isothiocyanate dan DTT yang terkandung dalam Trizol dapat membuka ikatan disulfida RNase, tetapi masih ada beberapa RNase, terutama pada sampel jaringan, jadi perhatikan suhu rendah.

1.Segera rendam sampel jaringan dalam nitrogen cair setelah mengeluarkannya, atau dalam larutan pengawet RNA komersial.

2.Setelah mengekstrak RNA sampel sel, tambahkan ke larutan lisis dan lisiskan di kotak es

3. Yang terbaik adalah menggunakan nitrogen cair untuk menggiling ketika sampel jaringan dihomogenkan.Saat menggunakan homogenizer elektrik tanpa nitrogen cair, perhatikan pendinginan awal adaptor homogenat sepenuhnya.

Yang kedua adalah DNase eksogen

1.Bersenjata lengkap, kenakan jas lab, kenakan masker, dan pastikan untuk memakai sarung tangan baru (jangan terlalu hemat!! Perlu dicatat bahwa Trizol sangat korosif, dan juga sangat kuat menembus sarung tangan, jadi jangan sampai menetes ke tangan Anda).

2.Semua ujung pipet bekas, tabung EP, tabung PCR, dan peralatan lainnya harus dirawat dengan de-RNase.Itu dapat direndam dalam 0,1% DEPC dan kemudian diberi tekanan di bawah tekanan tinggi.Perhatikan pengoperasian di lemari asam.Tiran lokal dapat langsung membeli bahan habis pakai untuk menghilangkan enzim.

PS: Izinkan saya memberi tahu Anda metode malas.Meskipun suhu tinggi dan tekanan tinggi tidak dapat sepenuhnya menghilangkan RNase, itu akan menghilangkan sebagian besar darinya.2 kali suhu tinggi dan tekanan tinggi memiliki efek yang baik, dan ekstraksi RNA memiliki efek yang kecil.

3.Alkohol dapat mendenaturasi protein,sehingga tabel ekstraksi RNA dapat dilap dengan alkohol 75%. , dan sarung tangan juga bisa disemprot dengan alkohol.

4.Larutan pelarutan RNA akhir dan tabung centrifuge juga harus dirawat dengan de-RNase.Air DEPC adalah larutan pelarut RNA yang umum digunakan.Mari kita bicara tentang metode persiapan air DEPC yang benar (ingat untuk mengemas ulang DEPC komersial saat Anda membelinya)

Tambahkan DEPC ke air ultra murni pada 1:1000, kocok rata, diamkan semalaman pada suhu 37°C, dan sterilkan pada suhu 121°C pada suhu tinggi dan tekanan tinggi selama 15 menit.Air DEPC dapat disimpan pada suhu -20°C dalam alikuot 1ml.

Akhirnya, untuk meringkas: suhu rendah adalah kuncinya, bahan habis pakai ditangani dengan baik, bersenjata lengkap, dan lebih sedikit bicara!

Nah, itu saja untuk strategi hari ini.Saya berharap Anda semua konsentrasi dan kemurnian RNA yang Anda sebutkan.Baik A260/A280 adalah 2.0!!!

Tentu saja, jika Anda menggunakan akit ekstraksi RNA operasi suhu kamar, Anda mungkin tidak mengalami masalah di atas.

Pengoperasian pada suhu kamar, tanpa menambahkan DNase, mengekstrak RNA total dari sel dalam 11 menit, dan mengekstrak RNA total dari jaringan hewan atau tanaman dalam 30 menit.

Untuk sampel uji coba, silakan hubungi:overseas@foregene.com

Produk-produk terkait:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/