• PCR adalah metode yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA dari sejumlah kecil cetakan DNA.RT-PCR menggunakan transkripsi terbalik untuk menghasilkan cetakan DNA dari sumber RNA yang kemudian dapat diamplifikasi.
• PCR dan RT-PCR biasanya merupakan reaksi titik akhir, sedangkan qPCR dan RT-qPCR menggunakan kinetika laju sintesis produk selama reaksi PCR untuk menghitung jumlah templat yang ada.
• Metode yang lebih baru, seperti PCR digital, memberikan kuantisasi absolut dari cetakan DNA awal, sedangkan metode seperti PCR isotermal mengurangi kebutuhan akan peralatan mahal untuk memberikan hasil yang dapat diandalkan.

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik biologi molekuler yang relatif sederhana dan banyak digunakan untuk memperkuat dan mendeteksi urutan DNA dan RNA.Dibandingkan dengan metode kloning dan amplifikasi DNA tradisional, yang seringkali memakan waktu berhari-hari, PCR hanya memerlukan beberapa jam.PCR sangat sensitif dan memerlukan template minimal untuk mendeteksi dan amplifikasi urutan tertentu.Metode dasar PCR telah berkembang lebih jauh dari deteksi DNA dan RNA sederhana.Di bawah ini, kami telah memberikan ikhtisar berbagai metode PCR dan reagen yang kami sediakan di Enzo Life Sciences untuk kebutuhan penelitian Anda.Kami bertujuan membantu para ilmuwan dengan cepat mengakses reagen PCR untuk digunakan dalam proyek penelitian mereka berikutnya!

PCR

Untuk PCR standar, yang Anda perlukan hanyalah DNA polimerase, magnesium, nukleotida, primer, cetakan DNA yang akan diamplifikasi, dan termosiklik.Mekanisme PCR sederhana sesuai dengan tujuannya: 1) DNA untai ganda (dsDNA) didenaturasi dengan panas, 2) primer sejajar dengan untai DNA tunggal, dan 3) primer diperpanjang oleh DNA polimerase, menghasilkan dua salinan dari DNA untai ganda. untai DNA asli.Proses denaturasi, anil, dan pemanjangan pada serangkaian suhu dan waktu dikenal sebagai satu siklus amplifikasi (Gbr. 1).

Setiap langkah siklus harus dioptimalkan untuk template dan set primer yang digunakan.Siklus ini diulang sekitar 20-40 kali, dan produk yang diperkuat kemudian dapat dianalisis, biasanya dengan gel agarosa (Gbr. 2).

Karena PCR merupakan metode yang sangat sensitif dan diperlukan volume yang sangat kecil untuk satu reaksi, maka disarankan untuk menyiapkan campuran induk untuk beberapa reaksi.Campuran induk harus tercampur dengan baik dan kemudian dipecah berdasarkan jumlah reaksi, memastikan bahwa setiap reaksi akan mengandung jumlah enzim, dNTP, dan primer yang sama.Banyak pemasok, seperti Enzo Life Sciences, juga menawarkan campuran PCR yang sudah mengandung semuanya kecuali primer dan cetakan DNA.

Daerah kaya Guanine/Cytosine (kaya GC) merupakan tantangan dalam teknik PCR standar.Sekuens yang kaya GC lebih stabil dibandingkan sekuens dengan kandungan GC lebih rendah.Selain itu, rangkaian kaya GC cenderung membentuk struktur sekunder, seperti loop jepit rambut.Akibatnya, untai ganda yang kaya GC sulit dipisahkan sepenuhnya selama fase denaturasi.Akibatnya, DNA polimerase tidak dapat mensintesis untai baru tanpa hambatan.Suhu denaturasi yang lebih tinggi dapat memperbaiki hal ini, dan penyesuaian terhadap suhu anil yang lebih tinggi serta waktu anil yang lebih pendek dapat mencegah pengikatan primer kaya GC yang tidak spesifik.Reagen tambahan dapat meningkatkan amplifikasi rangkaian kaya GC.DMSO, gliserol, dan betaine membantu mengganggu struktur sekunder yang disebabkan oleh interaksi GC dan dengan demikian memfasilitasi pemisahan untaian ganda.

PCR Mulai Panas

Amplifikasi yang tidak spesifik merupakan masalah yang dapat terjadi selama PCR.Kebanyakan DNA polimerase yang digunakan untuk PCR bekerja paling baik pada suhu sekitar 68°C hingga 72°C.Namun, enzim tersebut juga dapat aktif pada suhu yang lebih rendah, meskipun pada tingkat yang lebih rendah.Pada suhu jauh di bawah suhu anil, primer dapat mengikat secara non-spesifik dan menyebabkan amplifikasi non-spesifik, bahkan jika reaksi dilakukan di atas es.Hal ini dapat dicegah dengan menggunakan inhibitor polimerase yang berdisosiasi dari DNA polimerase hanya setelah suhu tertentu tercapai, maka istilah hot start PCR.Inhibitor dapat berupa antibodi yang mengikat polimerase dan mengalami denaturasi pada suhu denaturasi awal (biasanya 95°C).

Polimerase Fidelitas Tinggi

Meskipun DNA polimerase beramplifikasi dengan cukup akurat terhadap urutan cetakan aslinya, kesalahan dalam pencocokan nukleotida dapat terjadi.Ketidakcocokan dalam aplikasi seperti kloning dapat mengakibatkan transkrip terpotong, dan protein hilir salah diterjemahkan atau tidak aktif.Untuk menghindari ketidaksesuaian ini, polimerase dengan aktivitas “proofreading” telah diidentifikasi dan dimasukkan ke dalam alur kerja.Polimerase proofreading pertama, Pfu, diidentifikasi pada tahun 1991 di Pyrococcus furiosus.Enzim Pfu ini mempunyai aktivitas eksonuklease 3' sampai 5'.Saat DNA diamplifikasi, eksonuklease menghilangkan nukleotida yang tidak cocok pada ujung 3' untai.Nukleotida yang benar kemudian diganti, dan sintesis DNA berlanjut.Identifikasi urutan nukleotida yang salah didasarkan pada afinitas pengikatan nukleosida trifosfat yang benar dengan enzim, di mana pengikatan yang tidak efisien memperlambat sintesis dan memungkinkan penggantian yang benar.Aktivitas proofreading Pfu polimerase menghasilkan lebih sedikit kesalahan pada urutan akhir dibandingkan dengan Taq DNA polimerase.Dalam beberapa tahun terakhir, enzim proofreading lainnya telah diidentifikasi, dan modifikasi enzim Pfu asli telah dilakukan untuk mengurangi tingkat kesalahan selama amplifikasi DNA.

RT-PCR

PCR transkripsi terbalik, atau RT-PCR, memungkinkan penggunaan RNA sebagai templat.Langkah tambahan memungkinkan deteksi dan amplifikasi RNA.RNA ditranskripsi terbalik menjadi DNA komplementer (cDNA), menggunakan transkriptase balik.Kualitas dan kemurnian templat RNA sangat penting untuk keberhasilan RT-PCR.Langkah pertama RT-PCR adalah sintesis hibrida DNA/RNA.Transkriptase balik juga memiliki fungsi RNase H, yang mendegradasi bagian RNA dari hibrida.Molekul DNA untai tunggal kemudian diselesaikan oleh aktivitas DNA polimerase yang bergantung pada DNA dari transkriptase balik menjadi cDNA.Efisiensi reaksi untai pertama dapat mempengaruhi proses amplifikasi.Mulai saat ini, prosedur PCR standar digunakan untuk memperkuat cDNA.Kemungkinan untuk mengubah RNA menjadi cDNA dengan RT-PCR memiliki banyak keuntungan, dan ini terutama digunakan untuk analisis ekspresi gen.RNA beruntai tunggal dan sangat tidak stabil, sehingga sulit untuk dikerjakan.Ini biasanya berfungsi sebagai langkah pertama dalam qPCR, yang mengukur transkrip RNA dalam sampel biologis.

qPCR dan RT-qPCR

PCR kuantitatif (qPCR) digunakan untuk mendeteksi, mengkarakterisasi, dan mengukur asam nukleat untuk berbagai aplikasi.Dalam RT-qPCR, transkrip RNA sering kali diukur dengan menyalinnya secara terbalik menjadi cDNA terlebih dahulu, seperti dijelaskan di atas, dan kemudian dilakukan qPCR.Seperti pada PCR standar, DNA diperkuat melalui tiga langkah berulang: denaturasi, anil, dan pemanjangan.Namun, dalam qPCR, pelabelan fluoresen memungkinkan pengumpulan data seiring kemajuan PCR.Teknik ini memiliki banyak manfaat karena beragamnya metode dan bahan kimia yang tersedia.

Dalam qPCR berbasis pewarna (biasanya hijau), pelabelan fluoresen memungkinkan kuantifikasi molekul DNA yang diamplifikasi dengan menggunakan penggunaan pewarna pengikat dsDNA.Selama setiap siklus, fluoresensi diukur.Sinyal fluoresensi meningkat sebanding dengan jumlah DNA yang direplikasi.Oleh karena itu, DNA dikuantifikasi secara “real-time” (Gbr. 3).Kerugian dari qPCR berbasis pewarna adalah hanya satu target yang dapat diperiksa pada satu waktu dan pewarna akan berikatan dengan ds-DNA yang ada dalam sampel.

Dalam qPCR berbasis probe, banyak target dapat dideteksi secara bersamaan di setiap sampel, namun hal ini memerlukan optimalisasi dan desain probe spesifik target yang digunakan selain primer.Beberapa tipe desain probe tersedia, namun tipe yang paling umum adalah probe hidrolisis, yang menggabungkan fluorofor dan quencher.Transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) mencegah emisi fluorofor melalui pemadam saat probe masih utuh.Namun, selama reaksi PCR, probe dihidrolisis selama ekstensi primer dan amplifikasi urutan spesifik yang terikat padanya.Pembelahan probe memisahkan fluorofor dari pemadam dan menghasilkan peningkatan fluoresensi yang bergantung pada amplifikasi (Gbr. 4).Dengan demikian, sinyal fluoresensi dari reaksi qPCR berbasis probe sebanding dengan jumlah urutan target probe yang ada dalam sampel.Karena qPCR berbasis probe lebih spesifik dibandingkan qPCR berbasis pewarna, teknologi ini sering kali digunakan dalam pengujian diagnostik berbasis qPCR.

Amplifikasi Isotermal

Teknik PCR yang disebutkan di atas memerlukan peralatan thermocycling yang mahal untuk menaikkan dan menurunkan suhu ruang secara akurat untuk tahap denaturasi, anil, dan ekstensi.Sejumlah teknik telah dikembangkan yang tidak memerlukan perangkat yang presisi dan dapat dilakukan dalam penangas air sederhana atau bahkan di dalam sel yang diinginkan.Teknik-teknik ini secara kolektif disebut amplifikasi isotermal dan bekerja berdasarkan amplifikasi eksponensial, linier, atau kaskade.

Jenis amplifikasi isotermal yang paling terkenal adalah amplifikasi isotermal yang dimediasi loop, atau LAMP.LAMP menggunakan amplifikasi eksponensial pada suhu 65⁰C untuk memperkuat DNA atau RNA cetakan.Saat melakukan LAMP, empat hingga enam primer yang melengkapi daerah DNA target digunakan dengan DNA polimerase untuk mensintesis DNA baru.Dua dari primer ini memiliki sekuens komplementer yang mengenali sekuens pada primer lain dan mengikatnya, memungkinkan terbentuknya struktur “loop” pada DNA yang baru disintesis yang kemudian membantu anil primer pada putaran amplifikasi berikutnya.LAMP dapat divisualisasikan dengan berbagai metode, termasuk fluoresensi, elektroforesis gel agarosa, atau kolorimetri.Kemudahan dalam memvisualisasikan dan mendeteksi ada atau tidaknya produk dengan kolorimetri dan tidak memerlukan peralatan mahal menjadikan LAMP pilihan yang cocok untuk pengujian SARS-CoV-2 di area di mana pengujian laboratorium klinis tidak tersedia, atau penyimpanan dan pengangkutan sampel tidak layak dilakukan, atau di laboratorium yang sebelumnya tidak memiliki peralatan termosiklik PCR.