Reverse transcriptase tradisional tidak dapat mentolerir suhu tinggi (suhu optimal untuk aktivitas MMLV adalah 37-50°C, dan AMV adalah 42-60°C).RNA virus yang lebih kompleks tidak dapat secara efektif ditranskripsi balik menjadi cDNA pada suhu rendah, sehingga efisiensi deteksi berkurang.RT-qPCR tradisional umumnya membutuhkan partisipasi dua enzim kunci (reverse transcriptase dan DNA polimerase), yang membuatnya tidak mungkin untuk menyederhanakan pengoperasian sistem reaksi dan mengurangi biaya.Di sini kami akan memperkenalkan dua transkriptase balik tahan suhu tinggi, TtH dan RevTaq.Kedua enzim ini juga memiliki fungsi DNA polimerase, sehingga disebut enzim bifungsional.

TtH DNA polimerase

Anda pasti pernah mendengar tentang TtH yang berasal dari bakteri termofilik Thermus thermophilus HB8.Di hadapan kation divalen seperti Mg2+, ia memiliki aktivitas DNA polimerase.Ini banyak digunakan dalam reaksi PCR seperti enzim Taq, tetapi memiliki ketahanan panas yang lebih tinggi daripada enzim Taq, sehingga juga memiliki efek yang lebih baik pada PCR dengan templat konten GC tinggi.

· Enzim ini pada dasarnya tidak memiliki aktivitas eksonuklease 3′→5′ dan aktivitas eksonuklease 5′→3′, sehingga dapat juga digunakan untuk pengurutan dideoksi.

· Enzim ini memiliki aktivitas RTase.Di hadapan Mn2+, aktivitas RTase akan ditingkatkan.Dengan menggunakan fitur ini, dapat digunakan untuk melakukan reaksi transkripsi balik dan reaksi PCR dalam tabung yang sama, yaitu RT-PCR satu langkah.Namun, dengan adanya Mn2+, akurasi RT-PCR tidak tinggi.Aktivitas RT tidak ada hubungannya dengan aktivitas rnaase H.

· Peningkatan aktivitas Tth-DNA polimerase (pH9, optimal +55℃～+70℃, maksimum +95℃) mengatasi masalah yang disebabkan oleh struktur sekunder RNA.CDNA yang dihasilkan dapat diamplifikasi oleh PCR dengan enzim yang sama dengan adanya ion Mg2+.

· Kemampuan Tth-DNA polimerase untuk melakukan transkripsi balik dan amplifikasi DNA pada suhu tinggi membuat enzim ini berguna untuk RT-PCR kuantitatif, kloning, dan analisis ekspresi gen seluler dan RNA virus.
· Tth-DNA polimerase digunakan untuk RT-PCR untuk memperkuat RNA hingga 1kb.

Fitur dan keunggulan

DNA polimerase ke-t:

• Pastikan ukuran produk polymerase chain reaction (PCR) yang dioptimalkan, setidaknya 1000 bp dalam reaksi RT-PCR

• Terima deoksiribonukleosida trifosfat termodifikasi sebagai substrat

• Tidak terkait dengan aktivitas RNase H

• Memiliki stabilitas termal yang tinggi untuk mengatasi masalah, biasanya terkait dengan tingginya struktur sekunder yang ada pada RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimerase

DNA polimerase tahan panas dengan aktivitas reverse transcriptase

RevTaq-RT-PCR-DNA polimerase adalah enzim yang direkayasa, sangat tahan panas, berfungsi ganda dengan aktivitas reverse transcriptase dan DNA polimerase yang diperoleh melalui evolusi terarah dan buatan.

· Waktu paruh RevTaq RT-PCR DNA polimerase pada suhu 95°C lebih besar dari 40 menit.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase memungkinkan transkripsi balik suhu tinggi langsung dari templat RNA, dan langkah transkripsi balik dapat diulang beberapa kali untuk menghasilkan lebih banyak templat cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase memungkinkan RT-PCR “langkah nol” (tidak ada langkah transkripsi balik isotermal), karena pada langkah ekstensi PCR siklik, transkripsi balik dan amplifikasi DNA terjadi secara bersamaan.Ini juga mempromosikan reaksi transkripsi balik pada suhu tinggi, sehingga meminimalkan masalah yang dihadapi dalam melelehkan struktur sekunder yang kuat pada RNA pada suhu tinggi.

· Karena formula hot-start berbasis aptamer, RevTaq RT-PCR DNA polimerase akan menghasilkan hasil yang lebih baik ketika suhu anil dan ekstensi lebih tinggi dari 57°C.

· Karena enzim tahan panas, disarankan untuk merancang primer dan probe dengan titik leleh yang sangat tinggi (>60°C).

· Direkomendasikan untuk mengoptimalkan suhu langkah anil/ekstensi melalui gradien suhu selama proses pengaturan reaksi.

· Semakin tinggi suhu, semakin tinggi spesifisitas PCR.Siklus transkripsi balik biasanya dilakukan pada suhu yang lebih tinggi daripada siklus PCR, karena hibridisasi DNA Primer:Templat RNA biasanya memiliki titik lebur yang lebih tinggi daripada dupleks Templat DNA Primer:cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase direkayasa dan dioptimalkan secara genetik, dan ukuran amplikon antara 60-300 bp.

Batas deteksi DNA polimerase RevTaq RT-PCR mencapai 4 eksemplar/

Sistem reaksi yang dioptimalkan (pembentukan primer dengan titik leleh tinggi) ditunjukkan pada gambar.RevTaq RT-PCR RT-PCR yang digerakkan DNA polimerase menunjukkan sensitivitas yang lebih baik daripada campuran master RT-qPCR 1 langkah TaqPath, dan deteksi yang lebih rendah Gradien pengenceran sampel.

Lebih banyak keuntungan:

Fungsi mulai cepat → Langkah denaturasi termal awal dapat dilewati.

Formula aptamer hot-start → Memberikan aktivitas enzim 100% segera dan mencegah amplifikasi non-spesifik pada suhu rendah (<57°C).

Fungsi pembelahan → Langkah ekstraksi RNA dihilangkan, karena RevTaq RT-PCR DNA polimerase juga dapat memproses sampel reaksi kasar.Itu dapat segera menghancurkan membran sel eukariota, bakteri dan virus dalam siklus RT-PCR yang panas.

Tingkat bahan baku IVD → standar kualitas tinggi dan harga yang sangat kompetitif