Baru-baru ini, saya menemukan sesuatu yang luar biasa!Banyak profesional eksperimen tingkat lanjut di sekitarnya bahkan tidak mengetahui beberapa poin pengetahuan eksperimental yang sangat mendasar.

Misalnya, dapatkah Anda menjawab pertanyaan-pertanyaan berikut?

Apakah ada perbedaan antara OD260 dan A260?Apa artinya masing-masing?
OD adalah singkatan dari kerapatan optik (optical density), A adalah singkatan dari absorbansi (absorbansi), kedua konsep tersebut sebenarnya sama, “optical density” adalah “absorbance”, tetapi “optical density” sejalan dengan sebagian besar standar nasional dan lebih terstandarisasi.

Biasanya kita mengukur nilai OD pada 260nm untuk menghitung konsentrasi asam nukleat, jadi 1OD mewakili apa?
Asam nukleat memiliki puncak serapan maksimum pada panjang gelombang 260nm, yang mengandung DNA dan RNA, serta fragmen asam nukleat yang terfragmentasi (ini adalah poin kuncinya).
Nilai OD yang diukur pada panjang gelombang 260 nm dicatat sebagai OD260.Jika sampel murni, nilai OD260 dapat menghitung konsentrasi sampel asam nukleat.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (DNA beruntai ganda)
=37 μg/ml ssDNA (DNA beruntai tunggal)
=40 µg/ml RNA
=30 μg/ml dNTP (oligonukleotida)
Apakah ada hubungan dan perbedaan antara RT-PCR, Realtime-PCR dan QPCR?
RT-PCR adalah kependekan dari Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, kependekan dari Quantitative Real Time PCR
Meskipun PCR Waktu Nyata (PCR kuantitatif fluoresen waktu nyata) dan PCR Transkripsi Balik (PCR transkripsi terbalik) keduanya tampaknya disingkat sebagai RT-PCR.Tetapi konvensi internasionalnya adalah: RT-PCR secara khusus mengacu pada PCR transkripsi terbalik.

Apa nt, bp, dan kb yang umum digunakan untuk menggambarkan panjang DNA/RNA dalam biologi?
nt = nukleotida
bp = pasangan basa pasangan basa
kb = kilobase

Tentu saja, Anda akan mengatakan bahwa banyak orang tidak peduli dengan detail kecil ini!Semua orang melakukan ini, dan tidak ada yang akan menanyakan apa itu.Anda tahu ini tidak perlu, bukan?

Tidak, Tidak, Tidak, sangat penting untuk mengetahui hal ini!karena yang mana?
Karena Anda ingin memposting artikel!Saudara laki-laki!Apakah Anda bertujuan untuk lulus atau mengejar prestasi penelitian ilmiah, Anda harus mengandalkan artikel untuk berbicara!

Ekstraksi asam nukleat harus menjadi eksperimen yang paling sederhana dan mendasar.Kualitas ekstraksi asam nukleat secara langsung menentukan hasil percobaan selanjutnya.

Meski sudah saya katakan berkali-kali, masih banyak teman yang tidak peduli.Kali ini saya memutuskan untuk keluar dari artikel!

Informasi Minimum untuk Publikasi Eksperimen PCR Real-Time Kuantitatif, disebut sebagai MIQE, adalah seperangkat pedoman percobaan kuantitatif fluoresensi yang diluncurkan secara internasional, yang mengusulkan standar minimum untuk informasi eksperimental yang diperlukan untuk mengevaluasi percobaan PCR kuantitatif fluoresensi dan menerbitkan artikel.Melalui kondisi eksperimen dan metode analisis yang disediakan oleh eksperimen, peninjau dapat mengevaluasi dengan lebih baik validitas skema eksperimen peneliti.

Dapat dilihat bahwa pada bagian ekstraksi asam nukleat, item deteksi berikut telah diusulkan,

“E” menunjukkan informasi yang harus diberikan dan “D” menunjukkan informasi yang harus diberikan jika diperlukan.

Bentuknya sangat rumit, sebenarnya saya ingin mengatakan bahwa setiap orang harus memulai dari awal

kemurnian (D), hasil (D), integritas (E) dan konsistensi (E) untuk mengevaluasi asam nukleat dalam empat aspek tersebut.

Menurut kebiasaan percobaan, pertama-tama bicarakan tentang metode evaluasi kemurnian dan konsentrasi.

Pengukuran OD adalah metode deteksi favorit dan termudah bagi para peneliti.Adapun prinsipnya, saya tidak akan membahas detailnya di sini.Banyak laboratorium sekarang menggunakan spektrofotometer ultra-mikro untuk menganalisis sampel asam nukleat secara langsung secara kuantitatif.Sambil menampilkan nilai absorbansi, program langsung memberikan nilai konsentrasi (asam nukleat, protein dan pewarna fluoresen) dan rasio terkait.Adapun analisis nilai OD, Simpan gambar ini dan Anda akan baik-baik saja.

Daftar solusi nilai OD universal

Namun, ada beberapa peringatan yang perlu disampaikan secara terpisah untuk Anda.

(Lagipula, saya tahu Andalah yang harus menabung dan menunggu sampai Anda membutuhkannya!)

Catatan 1 Peralatan

Nilai OD akan dipengaruhi oleh peralatan yang berbeda.Selama OD260 berada dalam kisaran tertentu, nilai OD230 dan OD280 bermakna.Misalnya, rentang absorbansi Eppendorf D30 umum pada 260nm adalah 0~3A, dan NanoDrop One dari Thermo berada pada 260nm.Kisaran absorbansi 0,5 ~ 62,5A.

Catatan 2Reagen pengenceran

Nilai OD dapat dipengaruhi oleh pengenceran reagen yang berbeda.Misalnya, pembacaan OD260/280 dari RNA murni dalam pH7,5 10mM Trisbuffer antara 1.9-2.1, sementara dilarutan air netralrasionya akan lebih rendah, mungkin hanya 1,8-2,0, tetapi ini tidak berarti bahwa kualitas RNA berubah Perbedaan.

Catatan 3Zat sisa

Adanya zat sisa akan mempengaruhi keakuratan pengukuran konsentrasi asam nukleat, sehingga perlu untuk menghindari sebanyak mungkin residu protein, fenol, polisakarida dan polifenol dalam sampel asam nukleat.

Namun pada kenyataannya, ekstraksi dengan reagen organik merupakan metode lama.Dalam kit komersial, efek ekstraksi dapat dicapai melalui kolom adsorpsi berbasis silika yang dikombinasikan dengan sentrifugasi, menghindari reagen organik beracun dan berbahaya yang sulit dihilangkan, dll. Masalahnya, sepertiKit ekstraksi asam nukleat Foregene, tidak menggunakan DNase/RNase dan reagen organik beracun selama pengoperasian, cepat dan aman, danefek adalahBagus(sengaja bilang itu botak, tapi saya tahu kamu ingin tahu).

Contoh 1: Hasil dan kemurnian ekstraksi DNA genomik

Kit Isolasi DNA Tanah Foregene (DE-05511) mengolah sampel tanah dari berbagai sumber, dan jumlah dan kemurnian DNA genom yang diperoleh ditunjukkan pada tabel berikut:
Contoh 2: Hasil dan kemurnian ekstraksi RNA jaringan

Kit Isolasi RNA Total Hewan (RE-03012) memproses berbagai sampel jaringan, dan jumlah serta kemurnian RNA yang diperoleh ditunjukkan pada tabel di bawah ini (untuk jaringan tikus):
Namun, jangan berpikir bahwa Anda sudah selesai dengan nilai OD.Apakah Anda memiliki perhatian pada poin-poin penting yang saya gambarkan untuk Anda di depan?

Melihat

Molekul asam nukleat yang terfragmentasi juga akan diperhitungkan dalam absorbansi.Dengan asumsi bahwa Anda memiliki residu DNA genom dalam RNA, nilai OD Anda akan terlihat sangat tinggi, tetapi konsentrasi RNA yang sebenarnya tidak dapat ditentukan.Apakah RNA Anda Tidak jelas apakah ada degradasi, jadi kami masih membutuhkan metode evaluasi yang komprehensif untuk memberikan penilaian yang lebih akurat, yaitu evaluasi integritas asam nukleat yang disebutkan dalam MIQE.