1. Pengetahuan dasar (jika ingin melihat bagian eksperimental, silakan transfer langsung ke bagian kedua)
Sebagai reaksi turunan dari PCR konvensional, PCR waktu nyata terutama memantau perubahan jumlah produk amplifikasi dalam setiap siklus reaksi amplifikasi PCR secara waktu nyata melalui perubahan sinyal fluoresensi, dan secara kuantitatif menganalisis templat awal melalui hubungan antara nilai ct dan kurva standar .
Data spesifik RT-PCR adalahgaris dasar, ambang fluoresensiDanNilai Ct.
| dasar: | Nilai fluoresensi siklus 3-15 adalah garis dasar (baseline), yang disebabkan oleh kesalahan pengukuran yang sesekali terjadi. |
| Ambang batas (ambang): | Mengacu pada batas deteksi fluoresensi yang ditetapkan pada posisi yang sesuai di wilayah pertumbuhan eksponensial dari kurva amplifikasi, umumnya 10 kali standar deviasi garis dasar. |
| Nilai CT: | Ini adalah jumlah siklus PCR ketika nilai fluoresensi di setiap tabung reaksi mencapai ambang batas. Nilai Ct berbanding terbalik dengan jumlah template awal. |
Metode pelabelan umum untuk RT-PCR:
| metode | keuntungan | kekurangan | lingkup aplikasi |
| SYBR GreenⅠ | Penerapan yang luas, sensitif, murah dan nyaman | Persyaratan primer tinggi, rentan terhadap pita non-spesifik | Sangat cocok untuk analisis kuantitatif berbagai gen target, penelitian ekspresi gen, dan penelitian hewan dan tumbuhan rekombinan transgenik. |
| TaqMan | Spesifisitas yang baik dan pengulangan yang tinggi | Harganya tinggi dan hanya cocok untuk tujuan tertentu. | Deteksi patogen, penelitian gen resistensi obat, penilaian khasiat obat, diagnosis penyakit genetik. |
| suar molekuler | Spesifisitas tinggi, fluoresensi, latar belakang rendah | Harganya tinggi, hanya cocok untuk tujuan tertentu, desainnya sulit, dan harganya tinggi. | Analisis gen spesifik, analisis SNP |
2. Langkah-langkah percobaan
2.1 Tentang pengelompokan eksperimental- harus ada banyak sumur dalam grup, dan harus ada pengulangan biologis.
| ① | Kontrol kosong | Digunakan untuk mendeteksi status pertumbuhan sel dalam percobaan |
| ② | SiRNA kontrol negatif (urutan siRNA non-spesifik) | Tunjukkan kekhususan aksi RNAi.siRNA dapat menginduksi respons stres non-spesifik pada konsentrasi 200nM. |
| ③ | Kontrol Reagen Transfeksi | Kecualikan toksisitas reagen transfeksi ke sel atau efek pada ekspresi gen target |
| ④ | siRNA terhadap gen target | Hancurkan ekspresi gen target |
| ⑤ (opsional) | siRNA positif | Digunakan untuk memecahkan masalah sistem eksperimental dan masalah operasional |
| ⑥ (opsional) | SiRNA kontrol neon | Efisiensi transfeksi sel dapat diamati dengan mikroskop |
2.2 Prinsip desain primer
| Ukuran fragmen yang diperkuat | Sebaiknya pada 100-150bp |
| Panjang Primer | 18-25bp |
| konten GC | 30%-70%, sebaiknya 45%-55% |
| Nilai tm | 58-60 ℃ |
| Urutan | Hindari T/C terus menerus;A/G terus menerus |
| 3 urutan akhir | Hindari kaya GC atau kaya AT;basis terminal lebih disukai G atau C;yang terbaik adalah menghindari T |
| Komplementaritas | Hindari rangkaian komplementer lebih dari 3 basa di dalam primer atau di antara dua primer |
| Kekhususan | Gunakan pencarian ledakan untuk memastikan spesifisitas primer |
①SiRNA adalah spesifik spesies, dan urutan spesies yang berbeda akan berbeda.
②SiRNA dikemas dalam bubuk beku-kering, yang dapat disimpan secara stabil selama 2-4 minggu pada suhu kamar.
2.3 Alat atau reagen yang perlu disiapkan terlebih dahulu
| Primer (referensi internal) | Termasuk maju dan mundur dua |
| Primer (gen target) | Termasuk maju dan mundur dua |
| Target Si RNA (3 strip) | Umumnya, perusahaan akan mensintesis 3 strip, kemudian memilih salah satu dari ketiganya melalui RT-PCR |
| Kit Transfeksi | Lipo2000 dll. |
| Kit Ekstraksi Cepat RNA | Untuk ekstraksi RNA setelah transfeksi |
| Kit Transkripsi Balik Cepat | untuk sintesis cDNA |
| Kit Amplifikasi PCR | 2×Super SYBR Hijau campuran master qPCR |
2.4 Mengenai hal-hal yang perlu diperhatikan dalam langkah-langkah percobaan khusus:
①proses transfeksi siRNA
1. Untuk pelapisan, Anda dapat memilih pelat 24 sumur, pelat 12 sumur, atau pelat 6 sumur (rata-rata konsentrasi RNA yang diusulkan di setiap sumur dari pelat 24 sumur adalah sekitar 100-300 ng/uL), dan kepadatan sel transfeksi optimal hingga 60% -80% atau lebih
2. Langkah-langkah transfeksi dan persyaratan khusus secara ketat sesuai dengan instruksi.
3. Setelah transfeksi, sampel dapat diambil dalam waktu 24-72 jam untuk deteksi mRNA (RT-PCR) atau deteksi protein dalam waktu 48-96 jam (WB)
② Proses ekstraksi RNA
1. Mencegah kontaminasi oleh enzim eksogen.Ini terutama mencakup penggunaan masker dan sarung tangan secara ketat;menggunakan ujung pipet steril dan tabung EP;air yang digunakan dalam percobaan harus Bebas RNase.
2. Dianjurkan untuk melakukan dua kali seperti yang disarankan dalam kit ekstraksi cepat, yang benar-benar akan meningkatkan kemurnian dan hasil.
3. Cairan limbah tidak boleh menyentuh kolom RNA.
③ kuantifikasi RNA
Setelah RNA diekstraksi, dapat diukur langsung dengan Nanodrop , dan pembacaan minimum dapat serendah 10ng/ul.
④Membalikkan proses transkripsi
1. Karena sensitivitas RT-qPCR yang tinggi, setidaknya 3 sumur paralel harus dibuat untuk setiap sampel untuk mencegah Ct berikutnya terlalu berbeda atau SD terlalu besar untuk analisis statistik.
2. Jangan membekukan dan mencairkan campuran Master berulang kali.
3. Setiap tabung/lubang harus diganti dengan ujung yang baru!Jangan terus menerus menggunakan ujung pipet yang sama untuk menambahkan sampel!
4. Film yang menempel pada pelat 96-sumur setelah menambahkan sampel perlu dihaluskan dengan pelat.Yang terbaik adalah melakukan centrifuge sebelum meletakkannya di mesin, sehingga cairan di dinding tabung dapat mengalir ke bawah dan menghilangkan gelembung udara.
⑤Analisis kurva umum
| Tidak ada periode pertumbuhan logaritmik | Mungkin konsentrasi template yang tinggi |
| Tidak ada nilai CT | Langkah-langkah yang salah untuk mendeteksi sinyal fluoresen; degradasi primer atau probe – integritasnya dapat dideteksi dengan elektroforesis PAGE; jumlah templat yang tidak mencukupi; degradasi templat – menghindari masuknya kotoran dan pembekuan dan pencairan berulang dalam persiapan sampel; |
| Ct>38 | Efisiensi amplifikasi rendah;produk PCR terlalu panjang;berbagai komponen reaksi terdegradasi |
| Kurva amplifikasi linier | Probe mungkin sebagian terdegradasi oleh siklus beku-cair berulang atau paparan cahaya yang berkepanjangan |
| Perbedaan lubang duplikat sangat besar | Larutan reaksi tidak sepenuhnya meleleh atau larutan reaksi tidak tercampur;thermal bath instrumen PCR terkontaminasi oleh zat fluoresen |
2.5 Tentang analisis data
Analisis data qPCR dapat dibagi menjadi kuantifikasi relatif dan kuantifikasi absolut.Misalnya, sel pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan sel pada kelompok kontrol,
Berapa kali mRNA gen X berubah, ini adalah kuantifikasi relatif;dalam sejumlah sel tertentu, mRNA dari gen X
Berapa banyak salinan yang ada, ini adalah kuantifikasi mutlak.Biasanya yang paling sering kita gunakan di laboratorium adalah metode kuantitatif relatif.Biasanya,metode 2-ΔΔctpaling banyak digunakan dalam eksperimen , jadi hanya metode ini yang akan diperkenalkan secara mendetail di sini.
Metode 2-ΔΔct: Hasil yang diperoleh adalah perbedaan ekspresi gen target pada kelompok eksperimen dibandingkan dengan gen target pada kelompok kontrol.Diperlukan efisiensi amplifikasi dari gen target dan gen referensi internal mendekati 100%, dan deviasi relatif tidak boleh melebihi 5%.
Metode perhitungannya adalah sebagai berikut:
Δct kelompok kontrol = nilai ct gen target pada kelompok kontrol – nilai ct gen referensi internal pada kelompok kontrol
Δct kelompok eksperimen = nilai ct gen target pada kelompok eksperimen – nilai ct gen referensi internal pada kelompok eksperimen
ΔΔct=Δct grup eksperimen-Δct grup kontrol
Terakhir, hitung kelipatan perbedaan dalam level ekspresi:
Ubah Fold=2-ΔΔct (sesuai dengan fungsi excel adalah POWER)
Produk-produk terkait:
Waktu posting: Mei-20-2023
