Ⅰ. Meningkatkan sensitivitas sistem reaksi:
1. Pisahkan RNA berkualitas tinggi:
Sintesis cDNA yang sukses berasal dari RNA berkualitas tinggi.RNA berkualitas tinggi harus memastikan setidaknya total lebih lama dan tidak mengandung inhibitor yang tidak mengandung enzim perekam, seperti EDTA atau SDS.Kualitas RNA menentukan nilai maksimum dari informasi sekuens yang dapat Anda transkripsikan ke cDNA.Metode pemurnian RNA umum adalah metode langkah menggunakan isoocyanate/acidophenol.Untuk mencegah pencemaran RNase, RNA yang dipisahkan dari sampel yang kaya RNase (seperti pankreas) membutuhkan penyimpanan formaldehida untuk menyimpan RNA berkualitas tinggi, terlebih lagi untuk penyimpanan jangka panjang.RNA yang diekstraksi dari hati tikus pada dasarnya terdegradasi setelah satu minggu penyimpanan dalam air, sedangkan RNA yang diekstrak dari limpa tikus tetap stabil setelah tiga tahun penyimpanan dalam air.Selain itu, transkrip yang lebih besar dari 4kb lebih sensitif untuk melacak degradasi RNase daripada transkrip kecil.Untuk meningkatkan stabilitas penyimpanan sampel RNA, RNA dapat dilarutkan dalam methalmamine ion, dan disimpan -70 °C.Thylide yang digunakan untuk menyimpan RNA tidak boleh mengandung benda lain yang menurunkan RNA.RNA, yang berasal dari pankreas, dapat disimpan dalam methalmamine setidaknya selama satu tahun.Saat Anda siap menggunakan RNA, Anda dapat menggunakan metode berikut untuk mengendapkan RNA: tambahkan NaCl hingga 0,2 m dan 4 kali volume etanol, tempatkan suhu kamar selama 3-5 menit, dan sentrifugal 10.000 × g selama 5 menit.
2. Gunakan reverse transcriptase tanpa aktivitas RNaseH (RNaseH-):
Inhibitor RNase sering ditambahkan untuk membalikkan reaksi transkripsi untuk meningkatkan panjang dan hasil sintesis cDNA.Inhibitor RNase ditambahkan dalam reaksi sintesis berantai pertama dengan adanya buffer dan agen pereduksi seperti DTT karena proses sintesis pra-cDNA mendenaturasi inhibitor, sehingga melepaskan RNase terikat yang menurunkan RNA.Inhibitor protein RNase hanya mencegah degradasi RNA oleh RNase A, B, C, dan tidak mencegah RNase pada kulit, jadi berhati-hatilah agar tidak memasukkan RNase dari jari meskipun menggunakan inhibitor ini.
Reverse transcriptase mengkatalisis konversi RNA menjadi cDNA.Baik M-MLV dan AMV memiliki aktivitas RNaseH endogen selain aktivitas polimerase mereka sendiri.Aktivitas RNaseH bersaing dengan aktivitas polimerase untuk untaian heterozigot yang terbentuk antara templat RNA dan primer DNA atau untaian ekstensi cDNA, dan menurunkan RNA: untaian RNA dalam kompleks DNA.Templat RNA yang terdegradasi oleh aktivitas RNaseH tidak dapat lagi digunakan sebagai substrat yang efektif untuk sintesis cDNA, mengurangi hasil dan panjang sintesis cDNA.Dengan demikian menghilangkan atau sangat mengurangi aktivitas RNaseH dari reverse transcriptase akan sangat bermanfaat.
SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase dari RNaseH- dan thermoScript reverse transcriptase, AMV dari RNaseH- menghasilkan lebih banyak cDNA panjang penuh daripada MMLV dan AMV.Sensitivitas RT-PCR dipengaruhi oleh jumlah cDNA yang disintesis.ThermoScript jauh lebih sensitif daripada AMV.Ukuran produk RT-PCR dibatasi oleh kemampuan reverse transcriptase untuk mensintesis cDNA, terutama saat mengkloning Cdnas yang lebih besar.Dibandingkan dengan MMLV, SuperScripⅡ secara signifikan meningkatkan hasil produk RT-PCR yang panjang.Reverse transcriptase RNaseH- juga meningkatkan stabilitas termal, sehingga reaksi dapat dilakukan pada suhu yang lebih tinggi dari normal 37-42℃.Di bawah kondisi sintesis yang disarankan, primer oligo(dT) dan 10μCi [alpha-p]dCTP digunakan.Total produksi rantai pertama dihitung dengan menggunakan metode presipitasi TCA.CDNA panjang penuh dianalisis menggunakan penghilangan strip yang disortir berdasarkan ukuran dan dihitung dalam gel agarosa alkali.
3. Tingkatkan suhu pengawetan panas dari transkripsi terbalik：
Suhu penahanan yang lebih tinggi membantu membuka struktur sekunder RNA dan meningkatkan hasil reaksi.Untuk sebagian besar cetakan RNA, mempertahankan RNA dan primer pada suhu 65°C tanpa buffer atau garam dan kemudian mendinginkannya dengan cepat di atas es menghilangkan sebagian besar struktur sekunder dan memungkinkan primer untuk berikatan.Namun, beberapa cetakan masih memiliki struktur sekunder, bahkan setelah denaturasi termal.Amplifikasi template yang sulit ini dapat dilakukan dengan menggunakan ThermoScript reverse transcriptase dan dengan menempatkan reaksi reverse transcriptase pada suhu yang lebih tinggi untuk meningkatkan amplifikasi.Temperatur penahanan yang lebih tinggi juga dapat meningkatkan spesifisitas, terutama ketika sintesis cDNA dilakukan menggunakan primer spesifik gen (GSPS) (lihat Bab 3).Jika menggunakan GSP, pastikan nilai Tm primer sama dengan suhu penahan yang diharapkan.Jangan gunakan oligo(dT) dan primer acak di atas 60℃.Primer acak perlu dipertahankan pada 25 ℃ selama 10 menit sebelum meningkat menjadi 60 ℃.Selain menggunakan suhu transkripsi balik yang lebih tinggi, spesifisitas dapat ditingkatkan dengan langsung mentransfer campuran RNA / primer dari suhu denaturasi 65 ℃ ke suhu penahan transkripsi balik dan menambahkan campuran reaksi 2 × yang dipanaskan sebelumnya (sintesis inisiasi termal cDNA).Pendekatan ini membantu mencegah pasangan basa antarmolekul yang terjadi pada suhu yang lebih rendah.Menggunakan instrumen PCR menyederhanakan banyak sakelar suhu yang diperlukan untuk RT-PCR.
Polimerase yang distabilkan panas bertindak sebagai DNA polimerase dengan adanya Mg2+ dan RNA polimerase dengan adanya Mn2+.Itu bisa menahan panas hingga 65 ℃.Namun, kehadiran Mn2+ selama PCR mengurangi fidelitas, yang membuat polimerase Tth kurang cocok untuk amplifikasi presisi tinggi, seperti kloning cDNA.Selain itu, Tth kurang efisien pada transkripsi balik, yang mengurangi sensitivitas, dan karena satu enzim dapat melakukan transkripsi balik dan PCR, reaksi kontrol tanpa transkripsi balik tidak dapat digunakan untuk membedakan produk amplifikasi cDNA dari DNA genom yang terkontaminasi.
4. Aditif yang mendorong transkripsi terbalik：
Penambahan aditif, termasuk gliserin dan DMSO, pada reaksi sintesis berantai pertama dapat mengurangi stabilitas untai ganda asam nukleat dan melepaskan struktur sekunder RNA.Hingga 20% gliserin atau 10% DMSO dapat ditambahkan tanpa memengaruhi aktivitas SuperScriptⅡ atau MMLV.AMV juga dapat mentolerir hingga 20% gliserol tanpa mengurangi aktivitas.Untuk memaksimalkan sensitivitas RT-PCR dalam reaksi transkripsi balik SuperScriptⅡ, gliserol 10% dapat ditambahkan dan diisolasi pada suhu 45℃.Jika 1/10 produk reaksi retrotranskripsi ditambahkan ke PCR, konsentrasi gliserol dalam reaksi amplifikasi adalah 0,4%, yang tidak cukup untuk menghambat PCR.
5. Pemrosesan RNaseH：
Sensitivitas dapat ditingkatkan dengan memperlakukan reaksi sintesis cDNA dengan RNaseH sebelum PCR.Untuk beberapa templat, dianggap bahwa RNA dalam reaksi sintesis cDNA mencegah pengikatan produk yang diperkuat, dalam hal ini pengobatan RNaseH dapat meningkatkan sensitivitas.Secara umum, perawatan RNaseH diperlukan untuk amplifikasi templat target cDNA panjang penuh yang relatif panjang, seperti tuberous scherosisⅡ dengan salinan rendah.Untuk template yang sulit ini, RNaseH meningkatkan sinyal yang dihasilkan oleh cDNA yang disintesis oleh SuperScriptⅡ atau AMV.Untuk sebagian besar reaksi RT-PCR, pengobatan RNaseH bersifat opsional karena langkah denaturasi PCR berinsulasi 95℃ biasanya menghidrolisis RNA dari RNA: kompleks DNA.
6. Metode yang ditingkatkan untuk mendeteksi sejumlah kecil RNA：
RT-PCR sangat menantang ketika hanya sejumlah kecil RNA yang tersedia.Penambahan glikogen sebagai pembawa selama pemisahan RNA membantu meningkatkan hasil sampel kecil.Glikogen bebas RNase dapat ditambahkan bersamaan dengan Trizol.Glikogen larut dalam air dan dapat tetap berada dalam fase air dengan RNA untuk membantu pengendapan berikutnya.Konsentrasi glikogen bebas RNase yang direkomendasikan adalah 250μg/ml untuk sampel kurang dari 50mg jaringan atau 106 sel kultur.
Penambahan BSA asetat untuk membalikkan reaksi transkripsi menggunakan SuperScriptⅡ dapat meningkatkan sensitivitas, dan untuk sejumlah kecil RNA, mengurangi jumlah SuperScriptⅡ dan menambahkan 40 unit penghambat nuklease RnaseOut dapat meningkatkan tingkat deteksi.Jika glikogen digunakan dalam pemisahan RNA, penambahan penghambat BSA atau RNase untuk membalikkan reaksi transkripsi menggunakan SuperScriptⅡ tetap disarankan.
Ⅱ. Meningkatkan spesifisitas RT-PCR
1. sintesis cNDA：
Tiga metode berbeda dapat digunakan untuk memulai sintesis cDNA untai pertama, dan spesifisitas relatif dari masing-masing metode memengaruhi jumlah dan jenis cDNA yang disintesis.
Metode primer acak adalah yang paling tidak spesifik dari ketiga metode tersebut.Primer dianil di beberapa situs di seluruh transkrip untuk menghasilkan cDNA pendek dan panjang parsial.Metode ini sering digunakan untuk mendapatkan sekuens terminal 5' dan cDNA dari cetakan RNA dengan daerah struktural sekunder atau dengan situs terminasi yang tidak dapat direplikasi oleh reverse transcriptase.Untuk mendapatkan cDNA terpanjang, rasio primer terhadap RNA pada setiap sampel RNA perlu ditentukan secara empiris.Konsentrasi awal primer acak berkisar antara 50 hingga 250ng per sistem reaksi 20μl.Karena cDNA yang disintesis dari RNA total menggunakan primer acak sebagian besar adalah RNA ribosom, poli(A)+RNA umumnya dipilih sebagai templat.
Inisiasi Oligo(dT) lebih spesifik daripada primer acak.Ia berhibridisasi dengan ekor poli(A) yang ditemukan pada ujung 3′ mRNA di sebagian besar sel eukariotik.Karena poli(A)+RNA kira-kira 1% sampai 2% dari total RNA, jumlah dan kompleksitas cDNA jauh lebih sedikit daripada jika primer acak digunakan.Karena spesifisitasnya yang tinggi, oligo(dT) umumnya tidak memerlukan optimasi untuk rasio RNA terhadap primer dan pemilihan poli(A)+.Disarankan untuk menggunakan 0,5μg oligo(dT) per 20μl sistem reaksi.oligo(dT)12-18 cocok untuk sebagian besar RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR menyediakan oligo(dT)20 karena stabilitas termalnya yang baik dan cocok untuk suhu penahanan yang lebih tinggi.
Primer spesifik gen (GSP) adalah primer spesifik terbaik untuk langkah transkripsi terbalik.GSP adalah oligonukleosida antisense yang secara khusus dapat berhibridisasi dengan sekuens tujuan RNA, daripada menganil semua RNA seperti primer acak atau oligo(dT).Aturan yang digunakan untuk mendesain primer PCR juga berlaku untuk desain reaksi transkripsi balik GSP.GSP dapat menjadi urutan yang sama dengan primer amplifikasi yang dianil pada akhir mRNA3′, atau GSP dapat dirancang untuk dianil hilir dengan primer amplifikasi terbalik.Untuk beberapa objek yang diamplifikasi, diperlukan desain lebih dari satu primer antisense untuk keberhasilan RT-PCR karena struktur sekunder dari RNA target dapat mencegah pengikatan primer.Disarankan untuk menggunakan 1pmol antisense GSP dalam sistem reaksi sintesis berantai pertama 20μl.
2. Tingkatkan suhu pengawetan panas dari transkripsi terbalik：
Untuk mengambil keuntungan penuh dari spesifisitas GSP, reverse transcriptase dengan stabilitas termal yang tinggi harus digunakan.Transkriptase balik yang stabil terhadap panas dapat diisolasi pada suhu yang lebih tinggi untuk meningkatkan kekakuan reaksi.Misalnya, jika GSP dianil pada suhu 55°C, spesifisitas GSP tidak sepenuhnya digunakan jika transkripsi balik dilakukan pada suhu 37°C dengan kekakuan rendah menggunakan AMV atau M-MLV.Namun, SuperScripⅡ dan ThermoScript dapat bereaksi pada suhu 50℃ atau lebih tinggi, yang menghilangkan produk nonspesifik yang dihasilkan pada suhu lebih rendah.Untuk spesifisitas maksimum, campuran RNA/primer dapat ditransfer langsung dari suhu denaturasi 65℃ ke suhu penahan transkripsi terbalik dengan penambahan campuran reaksi 2 x yang dipanaskan sebelumnya (inisiasi termal sintesis cDNA).Ini membantu mencegah pasangan basa antar molekul pada suhu rendah.Menggunakan instrumen PCR menyederhanakan banyak transisi suhu yang diperlukan untuk RT-PCR.
3. Kurangi kontaminasi DNA genom：
Salah satu potensi kesulitan dengan RT-PCR adalah bahwa RNA mengkontaminasi DNA genomik.Penggunaan metode pemisahan RNA yang lebih baik, seperti Trizol Reagent, mengurangi kontaminasi DNA genom pada preparat RNA.Untuk menghindari produk yang dihasilkan dari DNA genomik, RNA dapat diobati dengan DNA tingkat amplifikasiⅠ untuk menghilangkan DNA yang terkontaminasi sebelum transkripsi terbalik.Sampel disimpan pada 65 ℃ dalam 2.0mM EDTA selama 10 menit untuk menghentikan pencernaan DNaseⅠ.EDTA mengkelat ion magnesium untuk mencegah hidrolisis RNA yang bergantung pada ion magnesium yang terjadi pada suhu tinggi.
Untuk memisahkan cDNA yang diamplifikasi dari produk amplifikasi DNA genom, primer yang dianil secara terpisah dengan ekson yang terpisah dapat dirancang.Produk PCR yang berasal dari cDNA akan lebih pendek daripada yang berasal dari DNA genom yang terkontaminasi.Eksperimen terkontrol tanpa transkripsi terbalik juga dilakukan pada setiap templat RNA untuk menentukan apakah fragmen yang diberikan berasal dari DNA genomik atau cDNA.Produk PCR diperoleh dengan tidak adanya transkripsi balik berasal dari genom.
Produk Terkait
RT-PCR MudahᵀᴹSaya (Satu Langkah)
- Kit satu langkah memungkinkan transkripsi terbalik dan PCR dilakukan dalam tabung yang sama.Itu hanya perlu menambahkan template RNA, primer PCR spesifik dan ddH RNase-Free2O.
-Analisis kuantitatif RNA secara real-time dapat dilakukan dengan cepat dan akurat.
Kit ini menggunakan reagen transkripsi balik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase yang dikombinasikan dengan sistem reaksi unik untuk secara efektif meningkatkan efisiensi amplifikasi dan spesifisitas reaksi.
-Sistem reaksi yang dioptimalkan membuat reaksi memiliki sensitivitas deteksi yang lebih tinggi, stabilitas termal yang lebih kuat, dan toleransi yang lebih baik.
-Kemampuan yang efisien untuk menghapus gDNA, yang dapat menghapus gDNA di template dalam waktu 2 menit.
-Sistem transkripsi balik yang efisien, hanya membutuhkan waktu 15 menit untuk menyelesaikan sintesis cDNA untai pertama.
-Template kompleks: template dengan konten GC tinggi dan struktur sekunder yang kompleks juga dapat dibalik dengan efisiensi tinggi.
-Sistem transkripsi balik sensitivitas tinggi, template tingkat pg juga bisa mendapatkan cDNA berkualitas tinggi.
-Sistem transkripsi terbalik memiliki stabilitas termal yang tinggi, suhu reaksi optimal adalah 42 ℃, dan masih memiliki kinerja transkripsi balik yang baik pada 50 ℃.
Waktu posting: Mar-07-2023
