PCR (polymerase chain reaction) adalah salah satu teknologi amplifikasi DNA in-vitro, dengan sejarah lebih dari 30 tahun.

Teknologi PCR dipelopori oleh Kary Mullis dari Cetus, AS pada tahun 1983. Mullis mengajukan paten PCR pada tahun 1985 dan menerbitkan makalah akademik PCR pertama tentang Sains pada tahun yang sama.Mullis dianugerahi Hadiah Nobel Kimia pada tahun 1993 untuk karyanya.

Prinsip Dasar PCR

PCR dapat memperkuat fragmen DNA target lebih dari satu juta kali.Prinsipnya adalah di bawah katalisis DNA polimerase, menggunakan DNA untai induk sebagai cetakan dan primer spesifik sebagai titik awal untuk perpanjangan.Ini direplikasi secara in vitro melalui langkah-langkah seperti denaturasi, anil, dan ekstensi.Proses DNA untai anak melengkapi DNA cetakan untai induk.

Proses PCR standar dibagi menjadi tiga langkah:

1. Denaturasi: Gunakan suhu tinggi untuk memisahkan untaian ganda DNA.Ikatan hidrogen antara untaian ganda DNA terputus pada suhu tinggi (93-98℃).

2.Annealing: Setelah DNA beruntai ganda dipisahkan, turunkan suhu agar primer dapat berikatan dengan DNA beruntai tunggal.

3. Ekstensi: DNA polimerase mulai mensintesis untai komplementer di sepanjang untai DNA dari ikatan primer ketika suhu diturunkan.Ketika ekstensi selesai, siklus selesai, dan jumlah fragmen DNA menjadi dua kali lipat

Mengulangi ketiga langkah ini 25-35 kali, jumlah fragmen DNA akan meningkat secara eksponensial.

Kecerdikan PCR adalah primer yang berbeda dapat dirancang untuk gen target yang berbeda, sehingga fragmen gen target dapat diamplifikasi dalam waktu singkat.

Selama ini PCR dapat dibagi menjadi tiga kategori, yaitu PCR biasa, PCR kuantitatif fluoresen, dan PCR digital.

PCR biasa generasi pertama

Gunakan instrumen amplifikasi PCR biasa untuk memperkuat gen target, lalu gunakan elektroforesis gel agarosa untuk mendeteksi produk, hanya analisis kualitatif yang dapat dilakukan.

Kerugian utama dari PCR generasi pertama:

1.Rawan terhadap amplifikasi non-spesifik dan hasil positif palsu.

2. Deteksi memakan waktu lama dan pengoperasiannya tidak praktis.

3.Hanya uji kualitatif yang dapat dilakukan

PCR Real-Time generasi kedua

Real-Time PCR, juga dikenal sebagai qPCR, menggunakan probe fluoresen yang dapat menunjukkan kemajuan sistem reaksi, dan memantau akumulasi produk yang diperkuat melalui akumulasi sinyal fluoresen, dan menilai hasilnya melalui kurva fluoresensi.Itu dapat diukur dengan bantuan nilai Cq dan kurva standar.

Karena teknologi qPCR dilakukan dalam sistem tertutup, kemungkinan kontaminasi berkurang, dan sinyal fluoresensi dapat dipantau untuk deteksi kuantitatif, sehingga paling banyak digunakan dalam praktik klinis dan telah menjadi teknologi dominan dalam PCR.

Zat fluoresen yang digunakan dalam PCR kuantitatif fluoresen waktu-nyata dapat dibagi menjadi: probe fluoresen TaqMan, suar molekuler, dan pewarna fluoresen.

1) Probe neon TaqMan:

Selama amplifikasi PCR, probe fluoresen spesifik ditambahkan sambil menambahkan sepasang primer.Probe adalah oligonukleotida, dan kedua ujungnya diberi label dengan kelompok fluoresen reporter dan kelompok fluoresen quencher.

Ketika probe utuh, sinyal fluoresen yang dipancarkan oleh kelompok reporter diserap oleh kelompok quenching;selama amplifikasi PCR, aktivitas exonuclease 5′-3′ dari enzim Taq membelah dan mendegradasi probe, membuat kelompok fluoresen reporter dan quencher.

2) Pewarna neon SYBR:

Dalam sistem reaksi PCR, kelebihan pewarna fluoresen SYBR ditambahkan.Setelah pewarna fluoresen SYBR secara non-spesifik dimasukkan ke dalam untai ganda DNA, ia memancarkan sinyal fluoresen.Molekul pewarna SYBR yang tidak dimasukkan ke dalam rantai tidak akan memancarkan sinyal fluoresen apa pun, sehingga memastikan sinyal fluoresen Peningkatan produk PCR sepenuhnya disinkronkan dengan peningkatan produk PCR.SYBR hanya berikatan dengan DNA beruntai ganda, sehingga kurva leleh dapat digunakan untuk menentukan apakah reaksi PCR spesifik.

3) Suar molekuler:

Ini adalah probe oligonukleotida berlabel ganda batang-loop yang membentuk struktur jepit rambut sekitar 8 basa pada ujung 5 dan 3.Sekuens asam nukleat pada kedua ujung saling berpasangan, menyebabkan gugus fluoresen dan gugus quenching menjadi rapat.Tutup, tidak ada fluoresensi yang akan dihasilkan.

Setelah produk PCR dihasilkan, selama proses anil, bagian tengah suar molekul dipasangkan dengan sekuens DNA spesifik, dan gen fluoresen dipisahkan dari gen quencher untuk menghasilkan fluoresensi.

Kerugian utama PCR generasi kedua:

Sensitivitas masih kurang, dan pendeteksian spesimen salinan rendah tidak akurat.

Ada pengaruh nilai latar belakang, dan hasilnya rentan terhadap gangguan.

Ketika terdapat penghambat PCR dalam sistem reaksi, hasil deteksi rentan terhadap gangguan.

PCR digital generasi ketiga

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) menghitung nomor salinan urutan target melalui deteksi titik akhir, dan dapat melakukan deteksi kuantitatif absolut yang akurat tanpa menggunakan kontrol internal dan kurva standar.

PCR digital menggunakan deteksi titik akhir dan tidak bergantung pada nilai Ct (ambang siklus), sehingga reaksi PCR digital kurang dipengaruhi oleh efisiensi amplifikasi, dan toleransi terhadap penghambat reaksi PCR ditingkatkan, dengan akurasi dan reproduktifitas tinggi.

Karena karakteristik sensitivitas tinggi dan akurasi tinggi, tidak mudah diganggu oleh penghambat reaksi PCR, dan dapat mencapai kuantifikasi absolut yang sebenarnya tanpa produk standar, yang telah menjadi hotspot penelitian dan aplikasi.

Menurut berbagai bentuk unit reaksi, dapat dibagi menjadi tiga jenis utama: mikrofluida, sistem chip dan droplet.

1) PCR digital mikrofluida, mdPCR:

Berdasarkan teknologi mikrofluida, templat DNA dipisahkan.Teknologi mikrofluida dapat mewujudkan peningkatan nano sampel atau pembentukan tetesan yang lebih kecil, tetapi tetesan tersebut memerlukan metode adsorpsi khusus dan kemudian digabungkan dengan sistem reaksi PCR.mdPCR secara bertahap telah diadopsi oleh metode lain menggantikan.

2) PCR digital berbasis tetesan, ddPCR:

Gunakan teknologi generasi tetesan air dalam minyak untuk memproses sampel menjadi tetesan, dan membagi sistem reaksi yang mengandung molekul asam nukleat menjadi ribuan tetesan berskala nano, yang masing-masing tidak mengandung molekul target asam nukleat untuk dideteksi, atau Mengandung satu hingga beberapa molekul target asam nukleat untuk diuji.

3) PCR digital berbasis chip, cdPCR:

Gunakan teknologi jalur cairan terintegrasi untuk mengukir banyak tabung mikro dan rongga mikro pada wafer silikon atau kaca kuarsa, dan kendalikan aliran larutan melalui katup kontrol yang berbeda, dan bagi cairan sampel menjadi nanometer dengan ukuran yang sama ke dalam sumur reaksi untuk Reaksi PCR digital untuk mencapai kuantifikasi absolut.

Kerugian utama dari PCR generasi ketiga:

Peralatan dan reagennya mahal.

Persyaratan kualitas template tinggi.Jika kuantitas template melebihi kuantitas sistem mikro, tidak mungkin untuk mengukur, dan jika terlalu kecil, akurasi kuantifikasi akan berkurang.

Positif palsu juga dapat dihasilkan ketika ada amplifikasi non-spesifik.