PCR, beberapa PCR, PCR di tempat, Membalikkan PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Kami akan memilah konsep, langkah, dan detail berbagai PCR

Ⅰ. PCR

Reaksi Rantai Polimerase, disebut sebagai PCR, adalah teknologi biologi molekuler yang digunakan untuk memperbesar fragmen DNA tertentu.Ini dapat dianggap sebagai replikasi DNA khusus in vitro.DNA polimerase (DNA Polymerase I) ditemukan pada awal tahun 1955, dan Fragmen Klenow dari E. Coli, yang memiliki nilai eksperimental dan kepraktisan, ditemukan oleh Dr. H. Klenow pada awal tahun 1970-an, tetapi karena enzim ini tidak mentolerir suhu, suhu tinggi dapat menurunkannya, sehingga tidak memenuhi reaksi berantai polimerase dengan degenerasi suhu tinggi.Enzim yang digunakan saat ini (disebut Taq polimerase), diisolasi dari Thermus aquaticus, bakteri mata air panas pada tahun 1976. Karakteristiknya adalah dapat menahan suhu tinggi dan merupakan enzim yang ideal, tetapi digunakan secara luas setelah tahun 1980-an.Konsep asli dari prototipe primitif asli PCR mirip dengan perbaikan dan penyalinan gen, yang diusulkan oleh Dr. KJell Kleppe pada tahun 1971. Dia menerbitkan salinan gen sederhana dan jangka pendek pertama (mirip dengan reaksi dua siklus pertama PCR).PCR yang dikembangkan saat ini dikembangkan oleh Dr. Kary B. Mullis pada tahun 1983. Dr. Mullis melayani perusahaan PE pada tahun tersebut, sehingga PE memiliki status khusus dalam industri PCR.Dr. Mullis secara resmi menerbitkan makalah terkait pertama dengan Saiki dan lainnya pada tahun 1985. Sejak itu, penggunaan PCR ribuan mil sehari, dan kualitas makalah terkait dapat dikatakan membuat banyak metode penelitian lainnya tidak dapat diterima.Selanjutnya, teknologi PCR banyak digunakan dalam penelitian ilmiah biologi dan aplikasi klinis, menjadi teknologi terpenting dalam penelitian biologi molekuler.Mullis juga memenangkan Hadiah Nobel Kimia tahun 1993.

PCRPrinsip

Prinsip dasar teknologi PCR mirip dengan proses replikasi alami DNA, dan spesifisitasnya bergantung pada primer oligonukleotida yang melengkapi kedua ujung urutan target.PCR terdiri dari degenerasi-anil-memperpanjang tiga langkah reaksi dasar: ①Degenerasi DNA templat: Setelah DNA templat dipanaskan hingga sekitar 93 ° C untuk jangka waktu tertentu, solusi DNA ganda untuk DNA rantai ganda yang dibentuk oleh amplifikasi PCR dari DNA templat Leaving, menjadikannya rantai tunggal sehingga dapat digabungkan dengan primer untuk mempersiapkan reaksi putaran berikutnya.②Annealing (senyawa) DNA cetakan dan primer: Setelah DNA cetakan dipanaskan dan diubah menjadi rantai tunggal, suhu turun menjadi sekitar 55°C.Urutan komplementer primer dan rantai tunggal DNA templat.③Perpanjangan primer: templat DNA-pengikatan primer didasarkan pada aksi TaqDNA polimerase, dengan dNTP sebagai bahan baku reaksi.Pertahankan prinsip replikasi, mensintesis rantai salinan semi-reserved baru yang melengkapi rantai DNA templat, dan ulangi siklus degenerasi-anil-ekstensi tiga proses bisa mendapatkan lebih banyak "rantai salinan semi-cadangan", dan rantai baru ini tersedia lagi Menjadi templat untuk siklus berikutnya.Dibutuhkan 2-4 menit untuk menyelesaikan loop, gen target dapat diamplifikasi beberapa juta kali dalam 2-3 jam.

StandarPCRSistem Reaksi

Lima elemen reaksi PCR

Ada lima jenis zat yang terlibat dalam reaksi PCR, yaitu primer, enzim, dNTP, template, dan buffer (diperlukan Mg2+).[prosedur PCR]

Proses PCR standar dibagi menjadi tiga langkah

1. Degenerasi DNA (90°C-96°C): Templat DNA rantai ganda di bawah aksi termal, ikatan hidrogen putus, membentuk DNA rantai tunggal.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Suhu sistem berkurang, primer digabungkan dengan templat DNA untuk membentuk rantai ganda lokal.

3. Perpanjangan (70 ℃ -75 ℃): Di bawah aksi enzim Taq (sekitar 72 ° C, aktivitas terbaik), dNTP digunakan sebagai bahan baku, memanjang dari ujung 5′ primer → ujung 3′, sintesis dan templat saling melengkapi rantai DNA lainnya.

Setiap siklus didenaturasi, dianil dan diperpanjang, menggandakan kandungan DNA.Saat ini, karena area amplifikasi yang pendek, beberapa PCR dapat direplikasi dalam waktu yang sangat singkat meskipun aktivitas enzim Taq tidak optimal, sehingga dapat diubah menjadi dua langkah, yaitu anil dan ekstensi dapat dilakukan pada suhu 60°C-65°C pada waktu yang bersamaan.Untuk mengurangi proses pengangkatan dan pendinginan serta meningkatkan kecepatan respons.

Fitur Reaksi PCR

● Kekhususan Tinggi

Faktor penentu spesifik dari respons PCR adalah: ①Kombinasi spesifik dari primer dan DNA cetakan.②Prinsip pasangan basa.③Loyalitas reaksi sintesis polimerase TaqDNA.④Kekhususan dan kekonservatifan gen target.

Kombinasi primer dan template yang tepat adalah kuncinya.Pengikatan primer dan templat serta perpanjangan rantai primer didasarkan pada prinsip pencocokan basa basa.Loyalitas reaksi sintesis polimerase dan ketahanan suhu tinggi dari Taq DNA polimerase membuat pengikatan (senyawa) template dan primer dalam reaksi dapat dilakukan pada suhu yang lebih tinggi.Spesifisitas kombinasi sangat meningkat.Klip dapat mempertahankan tingkat kebenaran yang tinggi.Dengan memilih wilayah genetik target dengan kekonservatifan tinggi dan kekonservatifan tinggi, spesifisitasnya lebih tinggi.

● Sensitivitas Tinggi

Volume produksi produk PCR meningkat berdasarkan indeks, yang dapat memperluas template awal Picker (PG=10-12) untuk meningkatkan level mikrokontroler ke level mikrogram (μg= -6).Sebuah sel target dapat dideteksi dari 1 juta sel;dalam pendeteksian virus, sensitivitas PCR bisa mencapai 3 RFUs (unit terbentuk titik kosong);tingkat deteksi minimum dalam ilmu bakteri adalah 3 bakteri.

● Sederhana dan Cepat

Refleksi PCR menggunakan Taq DNA polimerase suhu tinggi, yang menambahkan larutan reaksi pada satu waktu, yaitu reaksi degenerasi-anneal-ekstensi pada larutan amplifikasi DNA dan panci penangas air.Umumnya, reaksi amplifikasi selesai dalam 2 sampai 4 jam.Produk augmented umumnya dianalisis dengan pedang listrik, dan tidak harus menggunakan isotop, tidak ada polusi radioaktif, dan mudah dipromosikan.

● Kemurnian spesimen rendah

Tidak perlu memisahkan virus atau bakteri dan sel biakan.Produk mentah DNA dan RNA dapat digunakan sebagai penguat.Deteksi amplifikasi DNA dapat digunakan secara langsung menggunakan spesimen klinis seperti darah, cairan tubuh, cairan pencuci batuk, rambut, sel, dan jaringan hidup.

PCRmasalah umum

● Negatif palsu, tidak ada gelombang yang diperkuat

Tahapan kunci dari reaksi PCR meliputi: ① persiapan asam nukleat templat, ② kualitas dan spesifisitas primer, ③ kualitas enzim ④ kondisi siklus PCR.Menemukan alasannya juga harus dianalisis dan dipelajari untuk tautan di atas.

Templat: ① Templat berisi protein lain-lain, ② Templat berisi penghambat enzim Taq, ③ Protein dalam templat tidak dihilangkan, terutama protein golongan dalam kromosom.⑤ Degenerasi asam nukleat deminer tidak menyeluruh.Ketika kualitas enzim dan primer bagus, tidak ada pita amplifikasi, yang kemungkinan besar merupakan perlakuan pencernaan spesimen.Ada yang salah dengan proses ekstraksi asam nukleat template, sehingga untuk menyiapkan larutan digesti yang efektif dan stabil, prosedurnya harus diperbaiki dan tidak sembarangan diubah.

Inaktivasi enzim: enzim baru atau enzim lama dan baru harus digunakan bersama untuk menganalisis apakah aktivitas enzim hilang atau tidak mencukupi, yang mengarah ke negatif palsu.Perlu dicatat bahwa enzim Taq atau etidium bromida terkadang dilupakan.

Primer: kualitas primer, konsentrasi primer, dan apakah konsentrasi kedua primer simetris.Ini adalah alasan umum kegagalan PCR atau pita yang meningkat tidak ideal dan cenderung menyebar.Ada masalah dengan kualitas primer dari beberapa nomor batch.Kedua primer memiliki konsentrasi tinggi dan konsentrasi rendah, menyebabkan amplifikasi asimetris dengan efisiensi rendah.Penanggulangannya adalah: ① Pilih primer yang baik untuk mensintesis unit.② Konsentrasi primer tidak hanya bergantung pada nilai OD, tetapi juga memperhatikan cairan asli primer untuk membuat elektroforesis gel gula agar.Harus ada zona strip primer, dan kecerahan kedua primer harus konsisten secara umum.Belt, PCR mungkin gagal saat ini, dan harus diselesaikan dengan unit sintesis primer.Jika primernya tinggi, kecerahannya rendah, dan konsentrasinya harus seimbang saat diencerkan.③ Primer harus dibayar dan disimpan pada konsentrasi tinggi untuk mencegah pembekuan berulang atau bagian pendingin jangka panjang dari lemari es, yang akan menyebabkan primer memburuk dan terdegradasi.④ Desain primer tidak masuk akal, seperti panjang primer tidak mencukupi, dan kluster di terbentuk di antara primer.

Konsentrasi Mg2+: Konsentrasi ion Mg2+ berdampak besar pada efisiensi amplifikasi PCR.Konsentrasi yang berlebihan dapat mengurangi lawan jenis amplifikasi PCR.Jika konsentrasi terlalu rendah, output amplifikasi PCR malah akan membuat amplifikasi PCR gagal tanpa pita ekspansi.

Perubahan volume reaksi: Volume yang digunakan dalam amplifikasi PCR adalah 20ul, 30ul, dan 50ul atau 100uL, volume besar aplikasi untuk amplifikasi PCR diatur sesuai dengan tujuan penelitian ilmiah dan uji klinis yang berbeda.Setelah membuat volume kecil seperti 20ul, perlu membuat kondisi kabel saat membuat ukuran, jika tidak maka akan gagal.

Alasan fisik: Transformasi sangat penting untuk amplifikasi PCR.Jika suhu degenerasi rendah, waktu degenerasi singkat, kemungkinan terjadi negatif palsu;suhu anil yang terlalu rendah dapat menyebabkan amplifikasi non-spesifik dan mengurangi efisiensi amplifikasi spesifik.Sangat mempengaruhi kombinasi primer dan template untuk mengurangi efisiensi amplifikasi PCR.Kadang-kadang perlu menggunakan termometer standar untuk mendeteksi variabilitas, anil dan suhu yang diperpanjang pada ekstensi atau kompor yang larut dalam air, yang merupakan salah satu alasan kegagalan PCR.

Varian urutan target: Jika urutan target terjadi, mutasi atau penghapusan, kombinasi prototipe dan templat digabungkan, atau karena kurangnya urutan target, primer dan templat akan kehilangan urutan pelengkap, dan amplifikasi PCR-nya tidak akan berhasil.

● Positif palsu

Pita amplifikasi PCR tampak konsisten dengan pita urutan target, dan terkadang pitanya lebih rapi dan lebih tinggi.

Desain primer tidak sesuai: urutan amplifikasi yang dipilih dan urutan amplifikasi non-tujuan memiliki homolog, jadi ketika amplifikasi PCR, produk PCR yang diamplifikasi adalah urutan yang tidak bertujuan.Urutan target terlalu pendek atau primer terlalu pendek, dan cenderung positif palsu.Perlu didesain ulang.

Polusi silang dari urutan target atau produk amplifikasi: Ada dua alasan untuk polusi ini: Pertama, polusi silang dari seluruh genom atau segmen besar, yang mengarah ke positif palsu.Positif palsu semacam ini dapat diatasi dengan metode berikut: Berhati-hatilah dan berhati-hati selama operasi untuk mencegah urutan target terhirup ke dalam pistol sampel atau keluar dari tabung sentrifugal.Kecuali enzim dan zat yang tidak tahan suhu tinggi, semua reagen atau peralatan harus didesinfeksi dengan tekanan tinggi.Pipa dan sampel sentrifugal harus digunakan pada satu waktu.Bila perlu, sebelum menambahkan spesimen, tabung reaksi dan reagen disinari sinar ultraviolet untuk menghancurkan asam nukleat yang ada.Kedua, fragmen kecil dalam polusi udara.Fragmen kecil ini lebih pendek dari urutan target, tetapi memiliki homologi tertentu.Itu bisa disambung satu sama lain.Setelah melengkapi primer, produk PCR dapat diperluas, yang akan menyebabkan produksi positif palsu.Ini dapat digunakan untuk mengurangi atau menghilangkan metode PCR sarang.

● Muncul band amplifikasi nonspesifik

Pita yang muncul setelah amplifikasi PCR tidak konsisten dengan ukuran yang diharapkan, atau besar atau kecil, atau pada saat yang sama, atau pada saat yang sama, pita amplifikasi spesifik dan pita amplifikasi nonspesifik.Munculnya pita non-spesifik adalah: Pertama, primer tidak lengkap melengkapi urutan target, atau polimerisasi primer membentuk kluster di.Yang kedua adalah konsentrasi ion MG2+ terlalu tinggi, suhu anil terlalu rendah, dan jumlah siklus PCR terkait.Kedua, kualitas dan jumlah enzim.Seringkali, enzim dari beberapa sumber rentan terhadap pita non-khusus dan enzim dari sumber lain tidak terjadi.Terkadang amplifikasi enzim nonspesifik juga terjadi.Penanggulangannya adalah: dirancang ulang atraktif jika perlu.Kurangi jumlah enzim atau ganti enzim dari sumber lain.Kurangi jumlah primer, tambah jumlah templat dengan tepat, dan kurangi jumlah siklus.Tingkatkan suhu anil dengan benar atau gunakan metode dua titik suhu (degenerasi 93°C, anil, dan perpanjangan sekitar 65°C).

● Muncul derek atau selotip yang terkelupas

Amplifikasi PCR kadang-kadang tampak seperti sabuk yang diaplikasikan atau dikupas atau seperti karpet.Karena jumlah enzim yang berlebihan atau kualitas enzim yang buruk, konsentrasi dNTP terlalu tinggi, konsentrasi Mg2+ terlalu tinggi, suhu anil terlalu rendah, dan jumlah siklus terlalu banyak.Penanggulangannya adalah: ①Mengurangi jumlah enzim, atau mengubah enzim dari sumber lain.②Kurangi konsentrasi dNTP ③Kurangi konsentrasi Mg2+ dengan benar.④Meningkatkan jumlah template dan mengurangi jumlah siklus.

Produk-produk terkait

PCR Heroᵀᴹ (Dengan Pewarna)

◮ Kesetiaan yang lebih tinggi: 6 kali lipat dari enzim Taq biasa;

◮ Kecepatan amplifikasi lebih cepat

◮ Lebih banyak kemampuan beradaptasi template

◮ Efisiensi amplifikasi lebih tinggi

◮ Toleransi lingkungan lebih kuat: ditempatkan pada suhu 37°C selama seminggu, mempertahankan lebih dari 90% aktivitas;

◮ Memiliki aktivitas DNA polimerase 5'→3' dan aktivitas eksonuklease 5'→3', tanpa aktivitas eksonuklease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Dengan Pewarna)

Sistem reaksi yang unik dan Taq DNA Polymerase dengan efisiensi tinggi membuat reaksi PCR memiliki efisiensi amplifikasi, spesifisitas, dan sensitivitas yang lebih tinggi.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Satu Langkah)-SYBR Green I

◮ One-step kit membuat reverse transcription dan qPCR dua reaksi dalam tabung yang sama, hanya perlu menambahkan template RNA, primer PCR spesifik dan ddH Bebas RNase₂O.

◮ Kit dapat dengan cepat dan efisien menganalisis RNA virus atau melacak RNA secara kuantitatif.

◮ Kit ini menggunakan reagen transkripsi terbalik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase yang dikombinasikan dengan sistem reaksi unik untuk secara efektif meningkatkan efisiensi amplifikasi dan spesifisitas reaksi.

◮ Sistem reaksi yang dioptimalkan membuat reaksi memiliki sensitivitas deteksi yang lebih tinggi, stabilitas termal yang lebih kuat, dan toleransi yang lebih baik.

◮ RT-qPCR Mudah^TM(Satu Langkah) - Kit SYBR Green I dilengkapi dengan pewarna referensi internal ROX, yang dapat digunakan untuk menghilangkan latar belakang sinyal dan kesalahan sinyal di antara sumur, yang nyaman bagi pelanggan untuk digunakan dalam berbagai model instrumen PCR kuantitatif.

RT Mudah^TMII (Master Premiks untuk sintesis cDNA untai pertama untukPCR Waktu Nyata)

-Kemampuan yang efisien untuk menghapus gDNA, yang dapat menghapus gDNA di template dalam waktu 2 menit.

-Sistem transkripsi balik yang efisien, hanya membutuhkan waktu 15 menit untuk menyelesaikan sintesis cDNA untai pertama.

-Template kompleks: template dengan konten GC tinggi dan struktur sekunder yang kompleks juga dapat dibalik dengan efisiensi tinggi.

-Sistem transkripsi balik sensitivitas tinggi, template tingkat pg juga bisa mendapatkan cDNA berkualitas tinggi.

-Sistem transkripsi terbalik memiliki stabilitas termal yang tinggi, suhu reaksi optimal adalah 42 ℃, dan masih memiliki kinerja transkripsi balik yang baik pada 50 ℃.