PCR merupakan teknologi amplifikasi asam nukleat yang paling banyak digunakan dan banyak digunakan karena sensitivitas dan spesifisitasnya.Namun, PCR memerlukan denaturasi termal berulang dan tidak dapat menghilangkan keterbatasan mengandalkan instrumen dan peralatan, yang membatasi penerapannya dalam uji lapangan klinis.

Sejak awal 1990-an, banyak laboratorium mulai mengembangkan teknologi amplifikasi suhu konstan yang tidak memerlukan denaturasi termal.Sekarang mereka telah mengembangkan teknologi amplifikasi isotermal yang dimediasi loop, teknologi amplifikasi isotermal penggantian untai, teknologi amplifikasi isotermal lingkaran bergulir, dan ketergantungan urutan asam nukleat.Teknologi amplifikasi isotermal dan teknologi lainnya. 

Lamplifikasi isotermal yang dimediasi oop

Prinsip amplifikasi didasarkan pada fakta bahwa DNA berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis pada suhu sekitar 65°C.Ketika primer apa pun berpasangan basa dan diperluas ke bagian komplementer dari DNA beruntai ganda, untai lainnya akan berdisosiasi dan menjadi beruntai tunggal.

Pada suhu ini, DNA menggunakan 4 primer spesifik untuk bergantung pada polimerase DNA perpindahan untai untuk membuat sintesis DNA perpindahan untai bersirkulasi sendiri secara terus menerus.

Pertama-tama tentukan 6 regio spesifik F3, F2, F1, B1, B2, B3 pada gen target, lalu rancang 4 primer berdasarkan 6 regio spesifik tersebut (seperti terlihat pada gambar di bawah):

Forward inner primer (FIP) terdiri dari F1c dan F2.

Backward inner primer (BIP) terdiri dari B1c dan B2, dan TTTT digunakan sebagai spacer di tengah.

Primer luar F3 dan B3 masing-masing terdiri dari daerah F3 dan B3 pada gen target.

Dalam sistem reaksi LAMP, konsentrasi primer dalam beberapa kali lipat dari primer luar.Primer bagian dalam pertama-tama digabungkan dengan untai cetakan untuk mensintesis untai komplementer untuk membentuk untai ganda DNA.Selanjutnya, primer luar digabungkan dengan untai cetakan untuk membentuk untai ganda DNA.Di bawah aksi BstDNA polimerase, untai komplementer yang disintesis oleh primer dalam dilepaskan.Setelah serangkaian reaksi, untai komplementer akhirnya membentuk satu untai DNA dengan struktur halter.

Untai tunggal DNA struktur halter itu sendiri digunakan sebagai templat untuk terus membentuk DNA struktur loop batang transisi dengan ujung terbuka.Primer dalam dan luar memandu DNA struktur loop batang transisi untuk terus mengalami perpindahan untai dan reaksi ekstensi, dan akhirnya membentuk beberapa struktur loop batang dengan panjang yang berbeda.campuran DNA.

Keuntungan dan kerugian dari amplifikasi isotermal yang dimediasi loop

Keuntungan dari LAMPU:

(1) Efisiensi amplifikasi tinggi, yang secara efektif dapat memperkuat 1-10 salinan gen target dalam 1 jam, dan efisiensi amplifikasi 10-100 kali lipat dari PCR biasa.

(2) Waktu reaksinya singkat, spesifisitasnya kuat, dan tidak diperlukan peralatan khusus.

Kekurangan LAMP:

(1) Persyaratan primer sangat tinggi.

(2) Produk yang diperkuat tidak dapat digunakan untuk kloning dan pengurutan, tetapi hanya dapat digunakan untuk penilaian.

(3) Karena sensitivitasnya yang kuat, aerosol mudah terbentuk, menyebabkan positif palsu dan memengaruhi hasil tes.

Samplifikasi perpindahan trans

Amplifikasi perpindahan untai (SDA) adalah teknik amplifikasi DNA isotermal in vitro berdasarkan reaksi enzimatik yang pertama kali diusulkan oleh sarjana Amerika Walker pada tahun 1992.

Sistem dasar SDA meliputi endonuklease restriksi, polimerase DNA dengan aktivitas perpindahan untai, dua pasang primer, dNTP, dan ion kalsium dan magnesium serta sistem penyangga.

Prinsip amplifikasi perpindahan untai didasarkan pada urutan pengenalan endonuklease restriksi yang dimodifikasi secara kimiawi di kedua ujung DNA target.Endonuklease membuka celah pada untai DNA di tempat pengenalannya, dan DNA polimerase memperluas celah 3′ Akhiri dan mengganti untai DNA berikutnya.

Untaian tunggal DNA yang diganti dapat digabungkan dengan primer dan diperpanjang menjadi untaian ganda oleh DNA polimerase.Proses ini diulang terus menerus, sehingga urutan target diperkuat secara efisien.

Keuntungan dan kerugian dari teknologi amplifikasi perpindahan untai

Keuntungan SDA:

Efisiensi amplifikasinya tinggi, waktu reaksinya singkat, spesifisitasnya kuat, dan tidak diperlukan peralatan khusus.

Kekurangan SDA:

Produknya tidak seragam, dan beberapa produk beruntai tunggal dan beruntai ganda selalu diproduksi dalam siklus SDA, dan tailing pasti akan terjadi saat terdeteksi dengan elektroforesis.

Ramplifikasi lingkaran olling

Amplifikasi lingkaran bergulir (RCA) diusulkan dengan menggambarkan metode penyalinan DNA dari organisme patogen dengan lingkaran bergulir.Ini mengacu pada penggunaan DNA sirkular beruntai tunggal sebagai templat pada suhu konstan, dan DNA polimerase khusus (seperti Phi29) ) Di bawah aksi sintesis DNA lingkaran bergulir untuk mencapai amplifikasi gen target.

RCA dapat dibagi menjadi amplifikasi linier dan amplifikasi eksponensial.Efisiensi RCA linier bisa mencapai 10⁵kali, dan efisiensi eksponensial RCA bisa mencapai 10⁹waktu.

Perbedaan sederhana, seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah ini, amplifikasi linier a hanya menggunakan 1 primer, amplifikasi eksponensial b memiliki 2 primer.

Linear RCA juga disebut RCA primer tunggal.Primer berikatan dengan DNA sirkular dan diperpanjang oleh aksi DNA polimerase.Produknya adalah untai tunggal linier dengan sejumlah besar urutan berulang ribuan kali panjang satu putaran.

Karena produk RCA linier selalu terhubung ke primer awal, fiksasi sinyal yang mudah merupakan keuntungan utama.

RCA eksponensial, juga dikenal sebagai HRCA amplifikasi bercabang Hyper (Hyper branched RCA), dalam RCA eksponensial, satu primer memperkuat produk RCA, primer kedua berhibridisasi dengan produk RCA dan meluas, dan penggantinya sudah terikat pada produk RCA Primer hilir memperpanjang untai, dan ulangi ekstensi dan penggantian untuk menghasilkan produk amplifikasi RCA dendritik.

Keuntungan dan kerugian amplifikasi asam nukleat lingkaran bergulir

Kelebihan RCA:

Sensitivitas tinggi, spesifisitas yang baik, dan pengoperasian yang mudah.

Kekurangan RCA:

Masalah latar belakang selama deteksi sinyal.Selama reaksi RCA, probe gembok yang tidak diedarkan dan cetakan DNA atau RNA dari probe yang tidak terikat dapat menghasilkan beberapa sinyal latar belakang. 

Namplifikasi berbasis urutan asam ukleika

Amplifikasi berbasis urutan asam nukleat (NASBA) adalah teknologi baru yang dikembangkan berdasarkan PCR.Ini adalah amplifikasi asam nukleat kontinyu dan isotermal yang dipandu oleh sepasang primer dengan urutan promotor T7.Teknologi ini dapat memperkuat template RNA sekitar 109 kali dalam waktu sekitar 2 jam, yang 1000 kali lebih tinggi dari metode PCR konvensional dan tidak memerlukan peralatan khusus.

Teknologi ini telah digunakan untuk diagnosis cepat penyakit segera setelah muncul, dan banyak perusahaan saat ini menggunakan metode ini dalam alat pendeteksi RNA.

Meskipun amplifikasi RNA juga dapat menggunakan teknologi PCR transkripsi terbalik, NASBA memiliki kelebihannya sendiri: dapat dilakukan dalam kondisi suhu yang relatif konstan, dan lebih stabil dan akurat daripada teknologi PCR tradisional.

Reaksi terjadi pada suhu 41 derajat Celcius dan membutuhkan AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polimerase dan sepasang primer untuk menyelesaikannya.

Prosesnya terutama meliputi:

Primer maju berisi urutan komplementer dari promotor T7.Selama reaksi, primer depan berikatan dengan untai RNA dan dikatalisis oleh enzim AMV untuk membentuk untai ganda DNA-RNA.

RNase H mencerna RNA dalam untai ganda hibrida dan mempertahankan DNA untai tunggal.

Di bawah aksi primer terbalik dan enzim AMV, untai ganda DNA yang mengandung urutan promotor T7 terbentuk.

Di bawah aksi T7 RNA polimerase, proses transkripsi selesai dan sejumlah besar target RNA diproduksi.

Keuntungan NASBA:

(1) Primernya memiliki urutan promotor T7, tetapi DNA beruntai ganda asing tidak memiliki urutan promotor T7 dan tidak dapat diamplifikasi, sehingga teknologi ini memiliki spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi.

(2) NASBA secara langsung menggabungkan proses transkripsi terbalik ke dalam reaksi amplifikasi, mempersingkat waktu reaksi.

Kekurangan NASBA:

(1) Komponen reaksi lebih rumit.

(2) Diperlukan tiga jenis enzim untuk membuat biaya reaksi lebih tinggi.