Nilai Ct adalah bentuk presentasi hasil yang paling penting dari PCR kuantitatif fluoresen.Ini digunakan untuk menghitung perbedaan ekspresi gen atau nomor salinan gen.Jadi berapa nilai Ct dari kuantifikasi fluoresensi yang dianggap masuk akal?Bagaimana cara memastikan rentang nilai Ct yang efektif?
Apa itu Nilai Ct?
Selama proses amplifikasi qPCR, jumlah siklus amplifikasi yang sesuai ( Ambang Batas Siklus ) ketika sinyal fluoresensi dari produk yang diamplifikasi mencapai ambang batas fluoresensi yang ditetapkan.C adalah singkatan dari Cycle dan T adalah singkatan dari Threshold.Sederhananya, nilai Ct adalah jumlah siklus yang sesuai dengan saat amplifikasi template awal mencapai jumlah produk tertentu di qPCR.Apa yang disebut "sejumlah produk" akan dijelaskan lebih lanjut nanti.
Apa yang dilakukan nilai Ct?
1.Hubungan antara amplifikasi eksponensial, jumlah templat, dan nilai Ct
Idealnya, gen dalam qPCR diakumulasikan dengan amplifikasi eksponensial setelah sejumlah siklus.Hubungan antara jumlah siklus amplifikasi dan jumlah produk adalah: Jumlah produk yang diamplifikasi = jumlah template awal × (1+En) jumlah siklus.Namun, reaksi qPCR tidak selalu dalam situasi yang ideal.Ketika jumlah produk yang diperkuat mencapai "jumlah produk tertentu", jumlah siklus saat ini adalah nilai Ct, dan berada dalam periode amplifikasi eksponensial.Hubungan antara nilai Ct dan jumlah template awal: Ada hubungan linier antara nilai Ct template dan logaritma nomor salinan awal template.Semakin tinggi konsentrasi templat awal, semakin kecil nilai Ct;semakin rendah konsentrasi templat awal, semakin besar nilai Ct.
2. Kurva amplifikasi, ambang fluoresensi dan jumlah produk PCR tertentu
Jumlah produk amplifikasi qPCR disajikan langsung dalam bentuk sinyal fluoresen, yaitu kurva amplifikasi.Pada tahap awal PCR, amplifikasi dalam kondisi ideal, jumlah siklus kecil, akumulasi produk kecil, dan tingkat fluoresensi tidak dapat dibedakan dengan jelas dari latar belakang fluoresensi.Setelah itu, fluoresensi meningkat dan memasuki fase eksponensial.Jumlah produk PCR dapat dideteksi pada titik tertentu ketika reaksi PCR hanya dalam fase eksponensial, yang dapat digunakan sebagai "sejumlah produk tertentu", dan konten awal template dapat disimpulkan dari sini.Oleh karena itu, intensitas sinyal fluoresensi yang sesuai dengan jumlah produk tertentu adalah ambang fluoresensi.
Pada tahap akhir PCR, kurva amplifikasi tidak lagi menunjukkan amplifikasi eksponensial, dan memasuki fase linier dan fase dataran tinggi.
3.Reproduktifitas nilai Ct
Ketika siklus PCR mencapai nomor siklus dari nilai Ct, itu baru saja memasuki periode amplifikasi eksponensial yang sebenarnya.Saat ini, kesalahan kecil belum diamplifikasi, sehingga reproduktifitas nilai Ct sangat baik, yaitu template yang sama diamplifikasi pada waktu yang berbeda atau pada tabung yang berbeda pada waktu yang sama.Amplifikasi, nilai Ct yang diperoleh konstan.
1.Amplifikasi efisiensi En
Efisiensi amplifikasi PCR mengacu pada efisiensi polimerase yang mengubah gen yang akan diamplifikasi menjadi amplikon.Efisiensi amplifikasi ketika satu molekul DNA diubah menjadi dua molekul DNA adalah 100%.Efisiensi amplifikasi umumnya dinyatakan sebagai En.Untuk memfasilitasi analisis artikel selanjutnya, faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi amplifikasi diperkenalkan secara singkat.
| Faktor yang mempengaruhi | penjelasan | Bagaimana cara menilai? |
| A. Penghambat PCR | 1. DNA cetakan mengandung zat yang menghambat reaksi PCR, seperti protein atau detergen.2. CDNA setelah transkripsi balik mengandung komponen reagen RNA atau RT dengan konsentrasi tinggi, yang juga dapat menghambat reaksi PCR selanjutnya. | 1. Ada tidaknya polusi dapat dinilai dengan mengukur rasio A260/A280 dan A260/A230 atau elektroforesis RNA.2. Apakah cDNA diencerkan menurut rasio tertentu setelah transkripsi balik. |
| B. Desain primer yang tidak tepat | Primer tidak anil secara efisien | Periksa primer untuk primer-dimer atau jepit rambut, ketidakcocokan, dan terkadang mencakup desain intronik. |
| C. Rancangan program reaksi PCR yang tidak tepat | 1. Primer tidak dapat dianil secara efektif2. Pelepasan DNA polimerase yang tidak mencukupi 3. Aktivitas polimerase DNA suhu tinggi jangka panjang menurun | 1. Suhu anil lebih tinggi dari nilai TM primer2. Waktu pra-denaturasi terlalu singkat 3. Waktu setiap tahapan prosedur reaksi terlalu lama |
| D. Pencampuran reagen yang tidak memadai atau kesalahan pemipetan | Dalam sistem reaksi, konsentrasi komponen reaksi PCR lokal terlalu tinggi atau tidak merata, sehingga amplifikasi PCR amplifikasi non-eksponensial | |
| E. Panjang Amplikon | Panjang amplikon terlalu panjang, melebihi 300bp, dan efisiensi amplifikasi rendah | Pastikan panjang amplikon antara 80-300bp |
| F. Pengaruh reagen qPCR | Konsentrasi DNA polimerase dalam reagen rendah atau konsentrasi ion dalam buffer tidak optimal, mengakibatkan aktivitas enzim Taq tidak maksimal. | Penentuan efisiensi amplifikasi dengan kurva standar |
2.Rentang nilai Ct
Nilai Ct berkisar antara 15-35.Jika nilai Ct kurang dari 15, dianggap amplifikasi berada dalam kisaran periode dasar dan ambang fluoresensi belum tercapai.Idealnya, ada hubungan linier antara nilai Ct dan logaritma nomor salinan awal templat, yaitu kurva standar.Melalui kurva standar, ketika efisiensi amplifikasi adalah 100%, nilai Ct yang dihitung untuk menghitung jumlah salinan tunggal gen adalah sekitar 35. Jika lebih besar dari 35, jumlah salinan awal dari templat secara teoritis kurang dari 1, yang dapat dianggap tidak berarti.
Untuk rentang Ct gen yang berbeda, karena perbedaan jumlah salinan gen dan efisiensi amplifikasi dalam jumlah templat awal, perlu dibuat kurva standar untuk gen dan menghitung rentang deteksi linier gen.
3.Faktor yang mempengaruhi nilai Ct
Dari hubungan antara jumlah siklus amplifikasi dan jumlah produk: jumlah produk yang diamplifikasi = jumlah template awal × (1+En) nomor siklus, dapat dilihat bahwa pada kondisi ideal, jumlah template awal dan En akan berdampak negatif terhadap nilai Ct.Perbedaan kualitas template atau efisiensi amplifikasi akan menyebabkan nilai Ct terlalu besar atau terlalu kecil.
Nilai 4.Ct terlalu besar atau terlalu kecil
Waktu posting: Feb-22-2023
