Gangguan pendengaran (HL) adalah penyakit kecacatan sensorik yang paling umum pada manusia.Di negara maju, sekitar 80% kasus tuli prabahasa pada anak disebabkan oleh faktor genetik.Yang paling umum adalah cacat gen tunggal (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1), 124 mutasi gen telah ditemukan terkait dengan gangguan pendengaran nonsindromik pada manusia, sisanya disebabkan oleh faktor lingkungan.Implan koklea (perangkat elektronik yang ditempatkan di telinga bagian dalam yang memberikan stimulasi listrik langsung ke saraf pendengaran) sejauh ini merupakan pilihan paling efektif untuk mengobati HL parah, sedangkan alat bantu dengar (perangkat elektronik eksternal yang mengubah dan memperkuat gelombang suara) dapat membantu Pasien dengan HL sedang.Namun, saat ini tidak ada obat yang tersedia untuk mengobati HL (GHL) herediter.Dalam beberapa tahun terakhir, terapi gen mendapat perhatian yang meningkat sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk mengobati disfungsi telinga bagian dalam.

Gambar 1.Distribusi jenis variasi terkait ketulian.[1]

Baru-baru ini, para ilmuwan dari Salk Institute dan University of Sheffield menerbitkan hasil penelitian dalam Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], yang menunjukkan prospek aplikasi yang luas untuk terapi gen in vivo untuk ketulian herediter.Uri Manor, asisten profesor riset di Salk Institute dan direktur Waitt Center for Advanced Biophotonics, mengatakan dia terlahir dengan gangguan pendengaran yang parah dan merasa bahwa memulihkan pendengaran akan menjadi hadiah yang luar biasa.Penelitian sebelumnya menemukan bahwa Eps8 adalah protein pengatur aktin dengan aktivitas pengikatan dan pembatasan aktin;dalam sel rambut koklea, kompleks protein yang dibentuk oleh Eps8 dengan MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 dan GNAI3 terutama ada di sebagian besar ujung stereocilia panjang, yang bersama dengan MYO15A melokalisasi BAIAP2L2 di ujung stereocilia yang lebih pendek, diperlukan untuk pemeliharaan bundel rambut.Oleh karena itu, Eps8 dapat mengatur panjang stereosilia sel rambut, yang penting untuk fungsi pendengaran yang normal;Penghapusan atau mutasi Eps8 akan menyebabkan stereocilia pendek, yang membuatnya tidak dapat mengubah suara dengan baik menjadi sinyal listrik untuk persepsi otak, yang pada gilirannya menyebabkan ketulian..Pada saat yang sama, kolaborator Walter Marcotti, seorang profesor di Universitas Sheffield, menemukan bahwa sel rambut tidak dapat berkembang secara normal tanpa adanya Eps8.Dalam penelitian ini, Manor dan Marcotti bekerja sama untuk menyelidiki apakah menambahkan Eps8 ke sel stereociliary dapat mengembalikan fungsinya dan, pada gilirannya, meningkatkan pendengaran pada tikus.Tim peneliti menggunakan vektor adeno-associated virus (AAV) Anc80L65 untuk mengirimkan urutan pengkodean yang mengandung EPS8 tipe liar ke koklea Eps8-/- tikus P1-P2 yang baru lahir dengan injeksi membran jendela bundar;pada sel rambut koklea tikus Fungsi stereosilia diperbaiki sebelum menjadi dewasa;dan efek perbaikan ditandai dengan teknologi pencitraan dan pengukuran stereocilia.Hasilnya menunjukkan bahwa Eps8 meningkatkan panjang stereocilia dan mengembalikan fungsi sel rambut pada sel frekuensi rendah.Mereka juga menemukan bahwa, seiring waktu, sel-sel tampaknya kehilangan kemampuannya untuk diselamatkan oleh terapi gen ini.Implikasinya adalah bahwa perawatan ini mungkin perlu diberikan dalam rahim, karena sel rambut Eps8-/- mungkin telah matang atau kerusakan terakumulasi yang tidak dapat diperbaiki setelah tikus lahir."Eps8 adalah protein dengan banyak fungsi berbeda, dan masih banyak yang harus dijelajahi," kata Manor.Penelitian di masa depan akan mencakup menyelidiki efek terapi gen Eps8 dalam memulihkan pendengaran pada berbagai tahap perkembangan, dan apakah mungkin untuk memperpanjang peluang pengobatan.Secara kebetulan, pada November 2020, Profesor KarenB Avraham dari Universitas Tel Aviv di Israel menerbitkan hasilnya dalam jurnal EMBO Molecular Medicine [3], menggunakan teknologi terapi gen inovatif untuk membuat virus sintetik terkait adeno AAV9-PHP yang tidak berbahaya.B, Cacat gen pada sel-sel rambut tikus Syne4-/- diperbaiki dengan menyuntikkan virus yang membawa urutan pengkodean Syne4 ke telinga bagian dalam tikus, memungkinkannya memasuki sel-sel rambut dan melepaskan materi genetik yang dibawa, memungkinkan mereka menjadi dewasa dan berfungsi secara normal (seperti pada Gambar 2).

Gbr2.Representasi skema anatomi telinga bagian dalam, dengan fokus pada organ Corti dan fungsi seluler nesprin-4.

Dapat dilihat bahwa penggunaan terapi gen untuk mencapai tujuan mengobati penyakit keturunan pada tingkat gen dengan memasukkan, membuang atau mengoreksi gen yang bermutasi untuk pengobatan (yaitu, mengendalikan perubahan genetik pada penyakit) memiliki efek klinis yang tinggi.prospek aplikasi.Metode terapi gen saat ini untuk ketulian yang kekurangan genetik dapat dibagi ke dalam kategori berikut:

penggantian gen

Penggantian gen bisa dibilang merupakan bentuk terapi gen yang paling "langsung", berdasarkan identifikasi dan penggantian gen yang rusak dengan salinan gen normal atau tipe liar.Studi terapi gen telinga bagian dalam pertama yang berhasil untuk gangguan pendengaran yang disebabkan oleh penghapusan gen vesikular glutamat transporter 3 (VGLUT3);Pengiriman ekspresi berlebih VGLUT3 eksogen yang dimediasi AAV1 dalam sel rambut telinga bagian dalam (IHCs) Dapat menghasilkan pemulihan pendengaran yang berkelanjutan, pemulihan morfologi sinaptik pita parsial, dan respons kejang [4].Namun, dalam contoh termasuk dua penggantian gen yang dikirimkan AAV yang dijelaskan dalam pendahuluan di atas, penting untuk dicatat bahwa model tikus yang digunakan untuk beberapa jenis gangguan gangguan pendengaran herediter penghapusan gen sementara berbeda dari manusia, dan pada tikus P1 , telinga bagian dalam berada dalam tahap perkembangan yang matang.Sebaliknya, manusia dilahirkan dengan telinga bagian dalam yang matang.Perbedaan ini mencegah kemungkinan penerapan hasil tikus untuk pengobatan gangguan tuli herediter manusia kecuali terapi gen diberikan ke telinga tikus dewasa.

Pengeditan Gen: CRISPR/Cas9

Dibandingkan dengan “penggantian gen”, perkembangan teknologi pengeditan gen telah membawa fajar pengobatan penyakit genetik dari akarnya.Yang penting, metode pengeditan gen menutupi kekurangan metode terapi gen ekspresi berlebih tradisional yang tidak cocok untuk penyakit tuli herediter dominan, dan masalah bahwa metode ekspresi berlebih tidak bertahan lama.Setelah peneliti China secara khusus melumpuhkan alel mutan Myo6C442Y pada tikus Myo6WT/C442Y menggunakan sistem pengeditan gen AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, dan dalam waktu 5 bulan setelah sistem gugur, fungsi pendengaran model tikus dipulihkan;pada saat yang sama, juga diamati bahwa tingkat kelangsungan hidup sel rambut di telinga bagian dalam meningkat, bentuk silia menjadi teratur, dan indikator elektrofisiologi dikoreksi [5].Ini adalah studi pertama di dunia yang menggunakan teknologi CRISPR/Cas9 untuk pengobatan ketulian herediter yang disebabkan oleh mutasi gen Myo6, dan ini merupakan kemajuan penelitian penting dari teknologi pengeditan gen untuk pengobatan ketulian herediter.Terjemahan klinis pengobatan memberikan dasar ilmiah yang kuat.

Metode pengiriman terapi gen

Agar terapi gen berhasil, molekul DNA telanjang tidak dapat menembus sel secara efektif karena hidrofilisitas dan muatan negatif gugus fosfatnya, dan untuk memastikan integritas molekul asam nukleat tambahan, metode yang aman dan efektif harus dipilih.DNA tambahan dikirim ke sel atau jaringan target.AAV banyak digunakan sebagai sarana pengiriman untuk pengobatan penyakit karena efek infeksinya yang tinggi, imunogenisitas yang rendah, dan tropisme yang luas ke berbagai jenis jaringan.Saat ini, sejumlah besar pekerjaan penelitian telah menentukan tropisme subtipe AAV yang berbeda relatif terhadap tipe sel yang berbeda di koklea tikus.Menggunakan karakteristik pengiriman AAV yang dikombinasikan dengan promotor sel-spesifik dapat mencapai ekspresi sel-spesifik, yang dapat mengurangi efek di luar target.Selain itu, sebagai alternatif vektor AAV tradisional, vektor AAV sintetik baru terus dikembangkan dan menunjukkan kemampuan transduksi superior di telinga bagian dalam, di mana AAV2/Anc80L65 adalah yang paling banyak digunakan.Metode pengiriman non-virus dapat dibagi lagi menjadi metode fisik (mikroinjeksi dan elektroporasi) dan metode kimia (berbasis lipid, berbasis polimer, dan nanopartikel emas).Kedua pendekatan tersebut telah digunakan dalam pengobatan gangguan tuli herediter dan telah menunjukkan keuntungan dan keterbatasan yang berbeda.Selain kendaraan pengiriman untuk terapi gen sebagai kendaraan, pendekatan berbeda untuk administrasi gen in vivo dapat digunakan berdasarkan jenis sel target yang berbeda, rute pemberian, dan kemanjuran terapeutik.Struktur telinga bagian dalam yang rumit membuatnya sulit untuk mencapai sel target dan distribusi agen pengedit genom lambat.Labirin membran terletak di dalam labirin tulang tulang temporal dan termasuk saluran koklea, saluran setengah lingkaran, utrikulus, dan balon.Isolasi relatifnya, sirkulasi limfatik minimal, dan pemisahan dari darah oleh penghalang labirin darah membatasi pengiriman terapi sistemik yang efektif hanya ke tikus neonatal.Untuk mendapatkan titer virus yang cocok untuk terapi gen, diperlukan injeksi langsung vektor virus lokal ke telinga bagian dalam.Rute injeksi yang telah ditetapkan termasuk [6]: (1) membran jendela bundar (RWM), (2) trakeostomi, (3) kokleostomi endolimfatik atau perilimfatik, (4) membran jendela bundar ditambah fenestrasi Tube (CF) (seperti pada Gambar 3).

Gbr3.Pengiriman terapi gen telinga bagian dalam.

Meskipun banyak kemajuan telah dibuat dalam terapi gen, berdasarkan tujuan translasi klinis, lebih banyak pekerjaan yang harus dilakukan sebelum terapi gen dapat menjadi pilihan pengobatan lini pertama untuk pasien dengan penyakit genetik, terutama dalam pengembangan vektor yang aman dan efektif serta metode pengiriman.Namun kami percaya bahwa dalam waktu dekat, jenis perawatan ini akan menjadi pokok terapi pribadi dan akan memiliki dampak positif yang sangat besar pada kehidupan orang dengan kelainan genetik dan keluarga mereka.

Foregene juga telah meluncurkan kit skrining throughput tinggi untuk gen target, yang cepat dan dapat melakukan transkripsi balik dan reaksi qPCR tanpa ekstraksi RNA.

Tautan Produk

Kit RT-qPCR Sel Langsung—Taqman/SYBR GREEN I

Untuk informasi produk lebih lanjut, silahkan hubungi:

overseas@foregene.com