Saya percaya bahwa setiap orang akan selalu menemui masalah ini atau itu ketika melakukan reaksi PCR, tetapi kebanyakan dari mereka dapat diklasifikasikan menjadi dua masalah utama:

Terlalu sedikit amplifikasi dari templat gen (amplifikasi);
Terlalu banyak amplifikasi gen non-target.
Menggunakan aditif adalah salah satu strategi umum untuk memecahkan masalah ini.Biasanya peran aditif memiliki dua aspek:
struktur sekundergen (struktur sekunder);
Kurangi priming non-spesifik.
Hari ini, editor akan secara singkat memperkenalkan kepada Anda aditif umum dalam reaksi PCR dan fungsinya.
Aditif yang mengurangi struktur sekunder
sulfoksida(DMSO)
sampel gendengan kandungan GC tinggi.Namun, DMSO juga sangat mengurangi aktivitas polimerase Taq.Oleh karena itu, setiap orang harus menyeimbangkan aksesibilitas template dan aktivitas polimerase.Editor menyarankan agar Anda dapat mencoba berbagai konsentrasi DSMO, seperti dari 2% hingga 10%, untuk menemukan konsentrasi yang sesuai dengan eksperimen Anda.
Deterjen non-ionik
Deterjen non-ionik, seperti 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 atau NP-40, biasanya mengurangi struktur sekunder DNA.Meskipun hal ini dapat meningkatkan amplifikasi gen cetakan, hal ini juga akan menyebabkan masalah amplifikasi non-spesifik.Jadi, aditif ini bekerja dengan baik untuk reaksi PCR hasil rendah tanpa kotoran, tetapi tidak begitu baik untuk reaksi PRC yang relatif tidak murni.Manfaat lain dari deterjen non-ionik adalah pengurangan kontaminasi SDS.Biasanya selama proses ekstraksi DNA, SDS akan dibawa ke tahap PCR yang sangat menghambat aktivitas polimerase.Oleh karena itu, menambahkan 0,5% Tween-20 atau Tween-40 ke dalam reaksi dapat menetralkan efek negatif SDS.
Betaine_
Betaine dapat meningkatkan amplifikasi DNA dengan mengurangi pembentukan struktur sekunder dan umumnya merupakan tambahan "misteri" untuk kit PCR komersial.Jika Anda ingin menggunakan betaine, Anda harus memasukkan betaine atau betaine mono-hydrate (Betaine atau Betaine mono-hydrate), tetapi bukan betaine hydrochloride (Betaine HCl), sesuaikan dengan konsentrasi akhir 1-1,7M.Betaine juga dapat membantu meningkatkan spesifisitas karena menghilangkan ketergantungan komposisi pasangan basa dari peleburan DNA/denaturasi DNA.
Aditif untuk mengurangi priming non-spesifik
Formamida
Formamida adalah aditif PCR organik yang umum digunakan.Itu dapat bergabung dengan alur utama dan alur kecil dalam DNA, sehingga mengurangi stabilitas heliks ganda DNA master dan menurunkan suhu leleh DNA.Konsentrasi formamida yang digunakan dalam percobaan PCR biasanya 1%-5%.
Tetrametilamonium klorida( TMAC)
Tetrametilamonium klorida dapat meningkatkan spesifisitas hibridisasi (spesifisitas hibridisasi) dan meningkatkan suhu leleh DNA.Dengan demikian, TMAC dapat menghilangkan priming non-spesifik dan mengurangi kesalahan pengikatan DNA dan RNA.Jika Anda menggunakanprimer yang berdegenerasidalam reaksi PCR, ingat untuk menambahkan TMAC, yang biasa digunakan pada konsentrasi 15-100mM.
Aditif Umum Lainnya
Selain dua kategori aditif yang disebutkan di atas, ada banyak aditif umum dalam reaksi PCR, meskipun memiliki fungsi yang berbeda tetapi juga sangat penting.
ion magnesium
Ion magnesium adalah kofaktor (kofaktor) polimerase yang sangat diperlukan, artinya, tanpa ion magnesium, polimerase tidak aktif.Namun, terlalu banyak ion magnesium juga dapat mempengaruhi efisiensi polimerase.Konsentrasi ion magnesium pada setiap reaksi PCR akan berbeda-beda.Agen pengkhelat (seperti EDTA atau sitrat), konsentrasi dNTP dan protein semuanya memengaruhi konsentrasi ion magnesium.Jadi, jika Anda memiliki masalah dengan eksperimen PCR, Anda dapat mencoba mengubah konsentrasi ion magnesium yang berbeda, misalnya, dari 1,0 menjadi 4,0mM, dengan selang waktu 0,5–1mM di antaranya.
Perlu dicatat bahwa beberapa siklus beku-cair dapat menyebabkan stratifikasi konsentrasi larutan magnesium klorida.Oleh karena itu, Anda harus melarutkannya sepenuhnya sebelum digunakan, dan mencampurnya dengan baik sebelum digunakan.
Albumin serum sapi(albumin sapi, BSA)
Dalam percobaan kimia molekuler, albumin serum sapi adalah aditif yang sangat umum, terutama dalam pencernaan enzim restriksi dan percobaan PCR.Dalam reaksi PCR, BSA sangat membantu dalam mengurangi kontaminan seperti senyawa fenolik.Dan juga dikatakan dapat mengurangi daya rekat reaktan pada dinding tabung reaksi.Pada reaksi PCR, biasanya konsentrasi BSA yang ditambahkan bisa mencapai 0,8 mg/ml.
 
Produk-produk terkait:
Pahlawan PCR(dengan pewarna)
Pahlawan PCR