Memverifikasi kinerja primer dan probe pada tahap awal reagen PCR dan menentukan kondisi reaksi yang paling sesuai adalah prasyarat untuk memastikan kelancaran eksperimen formal.
Jadi bagaimana kita perlu mengkonfirmasi probe primer pada tahap awal?
Indikator utamanya adalah baseline, kurva amplifikasi, nilai ct, efisiensi amplifikasi, deteksi sampel konsentrasi rendah, CV, dll.
Garis dasar
Baseline adalah garis horizontal pada kurva amplifikasi PCR.Pada beberapa siklus pertama reaksi amplifikasi PCR, sinyal fluoresensi tidak banyak berubah dan membentuk garis lurus.Garis lurus ini adalah garis dasar.
Saat menyaring probe primer PCR, perhatikan apakah garis dasarnya rata.Kemurnian konsentrasi probe primer akan mempengaruhi baseline, seperti menyebabkan naik atau turunnya baseline.Baseline juga merupakan indikator yang sangat intuitif.
Kurva Amplifikasi
Indikator intuitif lainnya adalah bentuk kurva amplifikasi.Yang terbaik adalah memiliki kurva berbentuk S untuk menghindari amplifikasi sekunder atau kurva amplifikasi abnormal lainnya.
Nilai Ct
Jumlah siklus yang sesuai dengan titik belok dari baseline ke pertumbuhan eksponensial adalah nilai Ct.
Untuk sampel yang sama, probe primer yang berbeda menghasilkan kurva amplifikasi yang berbeda, dan nilai Ct yang sesuai akan dipengaruhi oleh efisiensi amplifikasi dan tingkat interferensi.Secara teori, semakin kecil nilai Ct dari probe primer yang kita pilih, semakin baik.
Efisiensi Amplifikasi
Salah satu metode yang paling andal dan stabil untuk mengevaluasi efisiensi amplifikasi PCR adalah kurva standar, yang juga diakui secara luas oleh para peneliti.Metode ini melibatkan pembuatan serangkaian sampel untuk mengontrol jumlah relatif template target.Sampel ini biasanya dibuat dengan pengenceran serial larutan stok pekat, yang paling umum digunakan adalah pengenceran 10 kali lipat.Menggunakan serangkaian sampel yang diencerkan, menggunakan program qPCR standar untuk memperkuat untuk mendapatkan nilai Cq, dan akhirnya menggambar kurva standar sesuai dengan konsentrasi masing-masing sampel dan nilai Cq yang sesuai untuk mendapatkan persamaan linier Cq= -klgX0+b, dan efisiensi amplifikasi E=10(-1 /k)-1.Saat menggunakan qPCR untuk analisis kuantitatif, efisiensi amplifikasi harus berada di kisaran 90%-110% (3.6>k>3.1).
Deteksi Sampel Konsentrasi Rendah
Ketika konsentrasi sampel rendah, tingkat deteksi probe primer yang berbeda berbeda.Kami memilih 20 sampel dengan konsentrasi rendah untuk ditiru, dan sistem probe primer dengan tingkat deteksi tertinggi adalah yang terbaik.
Koefisien Variasi (CV)
10 sampel duplikat dapat dideteksi dengan probe primer yang berbeda sesuai dengan standar garis reagen untuk deteksi amplifikasi asam nukleat.
Reagen Kuantitatif:
Ketepatan
Keakuratan dalam satu batch harus memenuhi: koefisien variasi (CV,%) dari nilai logaritma konsentrasi uji adalah ≤5%.Ketika konsentrasi sampel rendah, koefisien variasi (CV,%) dari logaritma konsentrasi deteksi adalah ≤10%
Reagen kualitatif:
Ketepatan
Akurasi dalam satu batch harus memenuhi:
(1) Koefisien variasi nilai Ct (CV,%) ≤5%
Sampel yang sama diuji secara paralel sebanyak 10 kali, dan hasil pengujian harus konsisten
Waktu posting: Sep-18-2021
