Pada tahap awal wabah, karena perkembangan yang pesat, diagnosis cepat pasien yang dicurigai adalah kunci pencegahan COVID-19.Beberapa reagen pendeteksi asam nukleat yang disetujui memiliki waktu pengembangan yang singkat, dan ada masalah seperti konfirmasi kinerja yang tergesa-gesa, optimalisasi reagen yang tidak memadai, dan perbedaan besar antar batch;Permasalahan berbagai laboratorium klinik dalam berbagai aspek proses deteksi asam nukleat juga dapat mempengaruhi keakuratan hasil deteksi asam nukleat.Artikel ini akan fokus pada tautan dan poin utama dalam deteksi asam nukleat SARS-CoV-2 saat ini, dan menganalisis masalah pemeriksaan ulang negatif dan positif palsu dari deteksi asam nukleat laboratorium dan inkonsistensi klinis.

Prinsip deteksi asam nukleat SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 adalah virus RNA dengan urutan genom sekitar 29 kb, dengan 10 gen, yang secara efektif dapat menyandikan 10 protein.Virus tersusun atas RNA dan protein, dan lapisan terluar adalah lapisan luar yang tersusun atas lipid dan glikoprotein.Di dalam, kapsid protein membungkus RNA di dalamnya, sehingga melindungi RNA yang mudah terurai (P1).

P1 Struktur SARS-COV-2

Virus menyerang sel melalui reseptor permukaan sel tertentu untuk menyebabkan infeksi, dan menggunakan sel inang untuk bereplikasi.

Prinsip deteksi asam nukleat virus adalah untuk mengekspos RNA virus melalui lisat sel, dan kemudian menggunakan reaksi berantai transkripsi-polimerase terbalik (RT-PCR) fluoresen waktu-nyata untuk deteksi.

Kunci dari prinsip deteksi adalah menggunakan primer dan probe untuk mencapai "pencocokan yang ditargetkan" dari sekuens asam nukleat, yaitu, untuk menemukan sekuens asam nukleat SARS-CoV-2 yang berbeda dari virus lain di sekitar 30.000 basa (kemiripan asam nukleat dengan virus lain) area "Rendah"), desain primer dan probe.

Primer dan probe sangat cocok dengan wilayah spesifik asam nukleat SARS-CoV-2, yaitu spesifisitasnya sangat kuat.Setelah hasil amplifikasi RT-PCR neon waktu-nyata dari sampel yang akan diuji positif, ini membuktikan bahwa SARS-CoV-2 ada dalam sampel.Lihat P2.

P2 Langkah penentuan asam nukleat SARS-CoV-2 (fluorescent RT-PCR waktu-nyata)

Kondisi dan persyaratan laboratorium untuk deteksi asam nukleat SARS-CoV-2

Laboratorium pengujian asam nukleat adalah yang paling ideal untuk lingkungan bertekanan negatif, dan harus memperhatikan pemantauan tekanan, menjaga aliran udara, dan menghilangkan aerosol.Personel penguji asam nukleat harus memiliki kualifikasi yang sesuai, menerima pelatihan reaksi berantai polimerase yang relevan, dan lulus penilaian.Laboratorium harus dikelola dengan ketat, diberi zona pada tempatnya, dan personel yang tidak relevan dilarang keras masuk.Area bersih harus berventilasi dan didesinfeksi di tempatnya.Barang-barang yang relevan ditempatkan di zona, bersih dan kotor dipisahkan, diganti tepat waktu, dan didekontaminasi pada tempatnya.Disinfeksi rutin: Disinfektan yang mengandung klorin adalah solusi utama untuk area yang lebih luas, dan alkohol 75% dapat digunakan untuk area kecil.Cara yang baik untuk menangani aerosol adalah dengan membuka jendela untuk ventilasi, dan desinfeksi udara juga dapat dilakukan dengan sinar ultraviolet, filtrasi, dan desinfeksi udara.

Tautan utama dan parameter penentuan asam nukleat SARS-CoV-2 (RT-PCR neon real-time)

Meskipun laboratorium umumnya memperhatikan “pendeteksian” asam nukleat, pada kenyataannya, “ekstraksi” asam nukleat juga merupakan salah satu langkah kunci untuk keberhasilan deteksi, yang terkait erat dengan pengumpulan dan penyimpanan sampel virus.

Saat ini, sampel pernapasan yang paling banyak digunakan, seperti swab nasofaring, menggunakan metode kedua, yaitu larutan inaktivasi (pengawetan) yang dibuat berdasarkan ekstraksi asam nukleat dan larutan lisis.Di satu sisi, solusi pengawetan virus ini dapat mendenaturasi protein virus, kehilangan aktivitasnya dan tidak lagi menular, serta meningkatkan keamanan tahap transportasi dan deteksi;di sisi lain, ia dapat langsung memecahkan virus untuk melepaskan asam nukleat, menghilangkan enzim pengurai asam nukleat, dan mencegah virus.RNA terdegradasi.

Larutan pengambilan sampel virus yang disiapkan berdasarkan larutan lisis ekstraksi asam nukleat.Komponen utamanya adalah garam seimbang, zat pengkhelat asam etilendiamintetraasetat, garam guanidin (guanidin isotiosianat, guanidin hidroklorida, dll.), surfaktan anionik (dodekana) Natrium sulfat), surfaktan kationik (tetradesil trimetil amonium oksalat), fenol, 8-hidroksiquinolin, dithiothreitol, proteinase K dan beberapa komponen lainnya atau lebih.Saat ini, ada banyak jenis kit ekstraksi asam nukleat, dan reagen ekstraksi dan pemurnian asam nukleat yang berbeda digunakan.Bahkan jika reagen ekstraksi dan pemurnian asam nukleat yang sama digunakan, prosedur ekstraksi masing-masing kit berbeda.

Saat ini, produk kit deteksi asam nukleat yang disetujui oleh National Medical Products Administration dipilih berdasarkan gen ORF1ab, E dan N dalam genom SARS-CoV-2.Prinsip pendeteksian produk yang berbeda pada dasarnya sama, tetapi primer dan desain probe berbeda.Ada segmen target tunggal (ORF1ab), segmen target ganda (ORF1ab, N atau E), dan segmen target tiga (ORF1ab, N dan E).Perbedaan antara deteksi dan interpretasi, ekstraksi asam nukleat dan sistem reaksi RT-PCR fluoresen real-time harus mengacu pada instruksi kit yang relevan, dan disarankan agar pengguna secara ketat mengikuti metode interpretasi yang ditentukan dalam instruksi kit untuk interpretasi.Wilayah umum, urutan primer dan probe yang diamplifikasi oleh RT-PCR fluoresen waktu-nyata ditunjukkan pada P3.

P3 Lokasi target amplikon SARS-CoV-2 pada genom dan urutan primer dan probe

Interpretasi hasil penentuan asam nukleat SARS-CoV-2 (Real-Time neon RT-PCR)

“Rencana Pencegahan dan Pengendalian Pneumonia untuk Infeksi SARS-CoV-2 (Edisi Kedua)” untuk pertama kalinya mengklarifikasi kriteria untuk menilai hasil amplifikasi gen tunggal:

1. Tidak ada Ct atau Ct≥40 yang negatif;

2. Ct<37 positif;

3. Nilai Ct 37-40 merupakan area gray-scale.Disarankan untuk mengulang percobaan.Jika hasil pengulangan Ct<40 dan kurva amplifikasi memiliki puncak yang jelas, sampel dinilai positif, jika tidak negatif.

Panduan edisi ketiga dan panduan edisi keempat melanjutkan kriteria di atas.Namun, karena perbedaan target yang digunakan dalam kit komersial, panduan edisi ke-3 tersebut tidak memberikan kriteria untuk menentukan kombinasi target, dengan menekankan bahwa instruksi yang diberikan oleh pabrikan akan berlaku.Mulai dari pedoman edisi kelima, dua target telah diperjelas, terutama kriteria penilaian untuk satu target yang sulit dinilai.Yaitu, jika laboratorium ingin memastikan bahwa suatu kasus positif untuk deteksi asam nukleat SARS-CoV-2, 1 dari 2 syarat berikut harus dipenuhi:

(1) Dua target SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) dalam sampel yang sama diuji positif dengan RT-PCR neon waktu-nyata.Jika satu target positif, diperlukan pengambilan sampel ulang dan pengujian ulang.Jika hasil tesnya Jika target tunggal masih positif, maka dinilai positif.

(2) Dua sampel RT-PCR fluoresen waktu-nyata menunjukkan satu target positif pada waktu yang sama atau dua sampel dari jenis yang sama menunjukkan hasil tes positif target tunggal, yang dapat dinilai sebagai positif.Namun, pedoman tersebut juga menekankan bahwa hasil negatif dari pengujian asam nukleat tidak dapat mengecualikan infeksi SARS-CoV-2.Faktor-faktor yang dapat menyebabkan negatif palsu perlu disingkirkan, termasuk kualitas sampel yang buruk (sampel pernapasan dari orofaring dan bagian lain), pengambilan sampel terlalu dini atau terlambat, Sampel tidak disimpan, diangkut, dan diproses dengan benar, dan teknologinya sendiri bermasalah (variasi virus, penghambatan PCR), dll.

Penyebab negatif palsu dalam deteksi SARS-CoV-2

Konsep “negatif palsu” dalam pengujian asam nukleat yang saat ini menjadi perhatian sering merujuk pada “negatif palsu” dimana hasil tes asam nukleat tidak sesuai dengan manifestasi klinis, yaitu gejala klinis dan hasil pencitraan sangat dicurigai adanya COVID-19, tetapi tes asam nukleat selalu “negatif” berkali-kali.Pusat Laboratorium Klinis Komisi Kesehatan Nasional menjelaskan tes SARS-CoV-2 “negatif palsu”.

(1) Ada sejumlah virus dalam sel orang yang terinfeksi.Data yang ada menunjukkan bahwa setelah tubuh terinfeksi virus, virus masuk ke tenggorokan melalui hidung dan mulut, lalu ke trakea dan bronkus, lalu mencapai alveoli.Orang yang terinfeksi akan mengalami masa inkubasi, gejala ringan, kemudian proses gejala berat, dan stadium penyakit yang berbeda.Dan jumlah virus yang ada di berbagai bagian tubuh berbeda.

Dalam hal viral load jenis sel, sel epitel alveolar (saluran pernapasan bawah)> sel epitel saluran napas (saluran pernapasan atas)> fibroblas, sel endotel, dan makrofag, dll.;dari jenis sampel, alveolar lavage fluid (the most Excellent)>dahak batuk dalam>swab nasofaring>swab orofaring>darah.Selain itu, virus juga dapat terdeteksi pada tinja.Namun, mengingat kenyamanan operasi dan penerimaan pasien, urutan sampel klinis yang umum digunakan adalah usap orofaring> usap nasofaring> cairan lavage bronkial (operasi kompleks) dan dahak yang dalam (biasanya batuk kering, sulit didapat).

Oleh karena itu, jumlah virus dalam sel orofaring atau nasofaring beberapa pasien kecil atau sangat rendah.Jika hanya sampel orofaring atau nasofaring yang diambil untuk pengujian, asam nukleat virus tidak akan terdeteksi.

(2) Tidak ada sel yang mengandung virus yang dikumpulkan selama pengumpulan sampel, atau asam nukleat virus tidak diawetkan secara efektif.

[① Situs pengumpulan yang tidak benar, misalnya, saat mengumpulkan swab orofaringeal, kedalaman pengumpulan tidak cukup, swab nasofaring yang terkumpul tidak terkumpul jauh di dalam rongga hidung, dll. Sebagian besar sel yang dikumpulkan mungkin merupakan sel bebas virus;

②Sampling swab digunakan secara tidak benar.Misalnya, serat sintetis seperti serat PE, serat poliester, dan serat polipropilena direkomendasikan untuk bahan kepala swab.Serat alami seperti kapas digunakan dalam operasi aktual (penyerapan protein yang kuat dan tidak mudah luntur) Dan serat nilon (penyerapan air yang buruk, menyebabkan volume pengambilan sampel tidak mencukupi);

③Penggunaan tabung penyimpanan virus yang salah, seperti penyalahgunaan tabung penyimpanan plastik polipropilen atau polietilen yang mudah menyerap asam nukleat (DNA/RNA), mengakibatkan penurunan konsentrasi asam nukleat dalam larutan penyimpanan.Dalam praktiknya, dianjurkan untuk menggunakan plastik polimer polietilen-propilena dan beberapa wadah plastik polipropilena yang diolah secara khusus untuk menyimpan asam nukleat virus.]

[① Situs pengumpulan yang tidak benar, misalnya, saat mengumpulkan swab orofaringeal, kedalaman pengumpulan tidak cukup, swab nasofaring yang terkumpul tidak terkumpul jauh di dalam rongga hidung, dll. Sebagian besar sel yang dikumpulkan mungkin merupakan sel bebas virus;

②Sampling swab digunakan secara tidak benar.Misalnya, serat sintetis seperti serat PE, serat poliester, dan serat polipropilena direkomendasikan untuk bahan kepala swab.Serat alami seperti kapas digunakan dalam operasi aktual (penyerapan protein yang kuat dan tidak mudah luntur) Dan serat nilon (penyerapan air yang buruk, menyebabkan volume pengambilan sampel tidak mencukupi);

③Penggunaan tabung penyimpanan virus yang salah, seperti penyalahgunaan tabung penyimpanan plastik polipropilen atau polietilen yang mudah menyerap asam nukleat (DNA/RNA), mengakibatkan penurunan konsentrasi asam nukleat dalam larutan penyimpanan.Dalam praktiknya, dianjurkan untuk menggunakan plastik polimer polietilen-propilena dan beberapa wadah plastik polipropilena yang diolah secara khusus untuk menyimpan asam nukleat virus.]

(4) Pelaksanaan laboratorium klinik tidak terstandarisasi.Transportasi sampel dan kondisi penyimpanan, standar operasi laboratorium klinis, interpretasi hasil dan kontrol kualitas adalah faktor kunci untuk memastikan keakuratan dan keandalan hasil tes.Berdasarkan hasil evaluasi mutu eksternal yang dilakukan Pusat Laboratorium Klinik Komnas Kesehatan pada 16-24 Maret 2020, dari 844 laboratorium yang mendapatkan hasil valid, 701 (83,1%) memenuhi syarat, dan 143 (16,9%) tidak memenuhi syarat.Memenuhi syarat, kondisi pengujian laboratorium secara keseluruhan baik, tetapi laboratorium yang berbeda masih memiliki perbedaan dalam kemampuan operasi personel, kemampuan interpretasi sampel positif target tunggal, dan kontrol kualitas.

Bagaimana cara mengurangi negatif palsu deteksi asam nukleat SARS-CoV-2?

Mengurangi negatif palsu dalam deteksi asam nukleat harus dioptimalkan dari empat aspek menghasilkan negatif palsu.

(1) Ada sejumlah virus dalam sel orang yang terinfeksi.Konsentrasi virus di berbagai bagian tubuh orang yang dicurigai terinfeksi akan berbeda pada waktu yang berbeda.Jika tidak ada faring, mungkin ada cairan atau feses bronkial.Jika beberapa jenis sampel dapat dikumpulkan pada waktu yang sama atau pada tahap perkembangan penyakit yang berbeda untuk pengujian, Akan membantu menghindari negatif palsu.

(2) Sel yang mengandung virus harus dikumpulkan selama pengambilan sampel.Masalah ini sebagian besar dapat diatasi dengan memperkuat pelatihan pengumpul sampel.

(3) Reagen IVD yang andal.Dengan melakukan penelitian evaluasi kinerja pendeteksian reagen di tingkat nasional, dan membahas masalah yang ada, efisiensi pendeteksian reagen dapat lebih ditingkatkan dan sensitivitas analisis dapat ditingkatkan.

(4) Operasi standar laboratorium klinik.Dengan memperkuat pelatihan pegawai laboratorium, terus meningkatkan sistem manajemen mutu laboratorium, memastikan pembagian yang masuk akal, dan meningkatkan kemampuan pegawai untuk mendeteksi, negatif palsu akibat operasi laboratorium yang tidak tepat dapat dikurangi.

Alasan tes ulang asam nukleat SARS-CoV-2 positif pada pasien sembuh dan pulang

“Rencana Diagnosis dan Perawatan COVID-19 (Percobaan Edisi Ketujuh)” dengan jelas menetapkan bahwa salah satu kriteria pasien COVID-19 untuk disembuhkan dan dipulangkan dari rumah sakit adalah bahwa dua sampel saluran pernapasan berturut-turut memiliki tes asam nukleat negatif (setidaknya selang waktu 24 jam), tetapi sangat sedikit Tes asam nukleat SARS-CoV-2 kembali positif pada pasien yang pulang karena berbagai alasan.

(1)SARS-CoV-2 adalah virus baru.Perlu dipahami lebih lanjut mekanisme patogeniknya, gambaran lengkap penyakit yang ditimbulkan dan ciri-ciri perjalanan penyakit.Oleh karena itu, di satu sisi perlu dilakukan penguatan tata laksana pasien rawat jalan dan observasi medis selama 14 hari.Melaksanakan tindak lanjut, pemantauan kesehatan dan pembinaan kesehatan untuk memperdalam pemahaman tentang keseluruhan proses terjadinya, perkembangan dan akibat penyakit.

(2) Pasien dapat terinfeksi virus lagi.Akademisi Zhong Nanshan berkata: Karena pasien yang sembuh memiliki antibodi, SARS-CoV-2 dapat dihilangkan oleh antibodi ketika mereka menyerang lagi.Ada banyak alasan, yang mungkin menjadi penyebab pasien sembuh, atau mungkin terkait dengan mutasi virus, atau bahkan penyebab pemeriksaan laboratorium.Jika itu adalah virus itu sendiri, mutasi SARS-CoV-2 dapat menyebabkan antibodi yang diproduksi oleh pasien yang sembuh menjadi tidak efektif melawan virus yang bermutasi.Jika pasien terinfeksi lagi dengan virus yang bermutasi, tes asam nukleat mungkin positif lagi.

(3) Mengenai metode pengujian laboratorium, setiap metode pengujian memiliki keterbatasan.Deteksi asam nukleat SARS-CoV-2 disebabkan oleh pilihan urutan gen, komposisi reagen, sensitivitas metode dan alasan lain, yang menyebabkan kit yang ada memiliki batas deteksi yang lebih rendah.Setelah pasien dirawat, virus di dalam tubuh berkurang.Ketika viral load dalam sampel yang akan diuji berada di bawah batas deteksi yang lebih rendah, hasil “negatif” akan muncul.Namun, hasil ini bukan berarti virus di dalam tubuh hilang sama sekali.Virus mungkin setelah pengobatan dihentikan.Kebangkitan”, terus menyalin.Oleh karena itu, disarankan untuk meninjau seminggu sekali dalam waktu 2 hingga 4 minggu setelah pemulangan.

(4) Asam nukleat adalah bahan genetik virus.Virus terbunuh setelah pasien menjalani pengobatan antivirus, tetapi fragmen RNA virus yang tersisa masih tertahan di tubuh manusia, dan tidak sepenuhnya dikeluarkan dari tubuh.Terkadang, dalam keadaan tertentu, itu bisa lebih dipertahankan.Lama sekali, dan saat ini tes asam nukleat akan positif "sementara".Dengan perpanjangan waktu pemulihan pasien, setelah fragmen RNA residu dalam tubuh secara bertahap habis, hasil tes asam nukleat dapat menjadi negatif.

(5) Hasil tes asam nukleat SARS-CoV-2 hanya membuktikan ada atau tidaknya RNA virus, dan tidak dapat membuktikan aktivitas virus dan apakah virus dapat menular.Perlu dibuktikan apakah pasien yang hasil tes asam nukleatnya positif kembali akan menjadi sumber infeksi kembali.Penting untuk melakukan kultur virus pada sampel klinis dan membiakkan virus "hidup" untuk membuktikan bahwa virus itu menular.

Ringkasan

Singkatnya, tes asam nukleat SARS-CoV-2 negatif palsu, tes ulang positif, dan kondisi lain yang tidak sesuai dengan manifestasi klinis tidak dapat sepenuhnya dihindari.Dalam skrining dan pengujian yang sebenarnya, dianjurkan untuk menggabungkan gejala klinis, pemeriksaan pencitraan (CT) dan percobaan Hasil tes laboratorium (tes asam nukleat + tes antibodi spesifik virus) untuk diagnosis komprehensif untuk mencegah diagnosis yang terlewat dan kesalahan diagnosis.Jika hasil tes ditemukan jelas tidak konsisten dengan manifestasi klinis, disarankan untuk melakukan analisis komprehensif dari seluruh tautan tes (pengumpulan sampel, sirkulasi dan tautan pemrosesan) untuk mengecualikan infeksi awal virus SARS-CoV-2, infeksi berulang atau dikombinasikan dengan infeksi virus pernapasan lainnya, dll.Jika kondisi memungkinkan, disarankan untuk mengumpulkan sampel yang lebih sensitif seperti dahak atau cairan alveolar lavage untuk pemeriksaan ulang.

Produk-produk terkait:

Kit Deteksi Asam Nukleat SARS-CoV-2 (Metode Pemeriksaan Fluorescent PCR Multipleks)