• facebook
  • linkedin
  • Youtube

Bahan awal: RNA

PCR transkripsi terbalik kuantitatif (RT-qPCR) adalah metode eksperimental yang digunakan dalam percobaan PCR menggunakan RNA sebagai bahan awal.Dalam metode ini, RNA total atau messenger RNA (mRNA) pertama kali ditranskripsi menjadi DNA komplementer (cDNA) oleh reverse transcriptase.Selanjutnya, reaksi qPCR dilakukan menggunakan cDNA sebagai templat.RT-qPCR telah digunakan dalam berbagai aplikasi biologi molekuler, termasuk analisis ekspresi gen, validasi interferensi RNA, validasi microarray, deteksi patogen, pengujian genetik, dan penelitian penyakit.

Metode satu langkah dan dua langkah untuk RT-qPCR

RT-qPCR dapat diselesaikan dengan metode satu langkah atau dua langkah.RT-qPCR satu langkah menggabungkan transkripsi terbalik dan amplifikasi PCR, memungkinkan transkriptase balik dan DNA polimerase untuk menyelesaikan reaksi dalam tabung yang sama di bawah kondisi buffer yang sama.RT-qPCR satu langkah hanya membutuhkan penggunaan primer spesifik urutan.Dalam RT-qPCR dua langkah, transkripsi balik dan amplifikasi PCR dilakukan dalam dua tabung, menggunakan buffer yang dioptimalkan berbeda, kondisi reaksi, dan strategi desain primer.

Pasal 1

 

Keuntungan

Kerugian

Satu langkah Metode ini memiliki kesalahan eksperimental yang lebih sedikit karena kedua reaksi dilakukan dalam satu tabung

 

Langkah pemipetan yang lebih sedikit mengurangi risiko kontaminasi

 

Cocok untuk amplifikasi/penyaringan throughput tinggi, cepat dan dapat direproduksi

Reaksi dua langkah tidak dapat dioptimalkan secara terpisah

 

Karena kondisi reaksi dikompromikan dengan menggabungkan reaksi dua langkah, sensitivitasnya tidak sebaik metode dua langkah.

 

Jumlah target yang terdeteksi oleh satu sampel kecil

Dua Langkah Kemampuan untuk membuat perpustakaan cDNA yang stabil yang dapat disimpan dalam jangka waktu lama dan digunakan dalam banyak reaksi

 

Gen target dan gen referensi dapat diamplifikasi dari perpustakaan cDNA yang sama tanpa memerlukan banyak perpustakaan cDNA

 

Buffer reaksi dan kondisi reaksi yang memungkinkan pengoptimalan proses reaksi tunggal

 

Pemilihan kondisi pemicu yang fleksibel

Menggunakan banyak tabung, dan lebih banyak langkah pemipetan meningkatkan risiko kontaminasi DNA,

dan memakan waktu.

 

Membutuhkan lebih banyak pengoptimalan daripada metode satu langkah

Produk-produk terkait:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Satu Langkah)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Satu Langkah)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix Untuk Sintesis CDNA Untai Pertama

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Pemilihan total RNA dan mRNA

Saat merancang eksperimen RT-qPCR, penting untuk memutuskan apakah akan menggunakan RNA total atau mRNA murni sebagai templat untuk transkripsi balik.Meskipun mRNA dapat memberikan sensitivitas yang sedikit lebih tinggi, RNA total masih sering digunakan.Alasannya adalah karena RNA total memiliki keunggulan yang lebih penting sebagai bahan awal daripada mRNA.Pertama, proses ini memerlukan langkah pemurnian yang lebih sedikit, yang memastikan pemulihan templat kuantitatif yang lebih baik dan normalisasi hasil yang lebih baik untuk nomor sel awal.Kedua, ini menghindari langkah pengayaan mRNA, yang dapat menghindari kemungkinan hasil yang miring karena pemulihan yang berbeda dari mRNA yang berbeda.Secara keseluruhan, karena dalam sebagian besar aplikasi kuantifikasi relatif dari gen target lebih penting daripada sensitivitas absolut dari deteksi, RNA total lebih cocok dalam kebanyakan kasus.

Primer transkripsi terbalik

Dalam metode dua langkah, tiga metode berbeda dapat digunakan untuk mengunggulkan reaksi cDNA: primer oligo(dT), primer acak, atau primer urutan spesifik.Biasanya, primer oligo(dT) dan primer acak digunakan dalam kombinasi.Primer-primer ini menempel pada untaian mRNA cetakan dan menyediakan transkriptase balik dengan titik awal untuk sintesis.

artikel2

Pemilihan primer Struktur dan fungsi Keuntungan Kerugian
Oligo(dT) primer (atau anchored oligo(dT) primer) Anil yang diperluas ke residu timin pada ekor mRNA poli(A);anchor oligo(dT) primer mengandung G, C, atau A pada ujung 3′ (situs jangkar) Sintesis cDNA panjang penuh dari mRNA berekor poli(A).

 

Berlaku bila bahan awal kurang tersedia

 

Situs penahan memastikan bahwa primer oligo(dT) berikatan dengan 5′ poli(A) ekor mRNA

Hanya cocok untuk mengamplifikasi gen dengan ekor poli(A).

 

Dapatkan cDNA terpotong dari situs priming*2 dalam poli(A)

 

Bias untuk mengikat ujung 3′*

 

*Kemungkinan ini diminimalkan jika primer oligo(dT) jangkar digunakan

primer acak

 

Panjangnya 6 hingga 9 basa, yang dapat dianil ke banyak situs selama transkripsi RNA Anneal ke semua RNA (tRNA, rRNA, dan mRNA)

 

Cocok untuk transkrip dengan struktur sekunder yang signifikan, atau ketika bahan awal yang tersedia kurang

 

Hasil cDNA Tinggi

cDNA ditranskripsi terbalik dari semua RNA, yang biasanya tidak diinginkan dan dapat melemahkan sinyal mRNA target

 

mendapatkan cDNA terpotong

primer urutan-spesifik Primer khusus yang menargetkan urutan mRNA tertentu perpustakaan cDNA tertentu

 

Meningkatkan kepekaan

 

Menggunakan primer qPCR terbalik

Hanya terbatas pada sintesis gen target tunggal

Membalikkan transkriptase

Reverse transcriptase adalah enzim yang menggunakan RNA untuk mensintesis DNA.Beberapa reverse transcriptase memiliki aktivitas RNase dan dapat menurunkan untaian RNA pada untaian hibrida RNA-DNA setelah transkripsi.Jika tidak memiliki aktivitas enzimatik RNase, RNaseH dapat ditambahkan untuk efisiensi qPCR yang lebih tinggi.Enzim yang biasa digunakan termasuk Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase dan avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Untuk RT-qPCR, sangat ideal untuk memilih reverse transcriptase dengan termostabilitas yang lebih tinggi, sehingga sintesis cDNA dapat dilakukan pada suhu yang lebih tinggi, memastikan keberhasilan transkripsi RNA dengan struktur sekunder yang lebih tinggi, sambil mempertahankan aktivitas penuhnya selama reaksi, menghasilkan hasil cDNA yang lebih tinggi.

Produk-produk terkait:

Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase

Aktivitas RNase H dari reverse transcriptase

RNaseH mampu menurunkan untaian RNA dari dupleks RNA-DNA, memungkinkan sintesis DNA beruntai ganda yang efisien.Namun, saat menggunakan mRNA panjang sebagai templat, RNA dapat terdegradasi sebelum waktunya, menghasilkan cDNA terpotong.Oleh karena itu, seringkali bermanfaat untuk meminimalkan aktivitas RNaseH selama kloning cDNA jika diinginkan sintesis transkrip panjang.Sebaliknya, reverse transcriptase dengan aktivitas RNase H sering bermanfaat untuk aplikasi qPCR karena meningkatkan peleburan dupleks RNA-DNA selama siklus pertama PCR.

Desain primer

Primer PCR yang digunakan untuk langkah qPCR di RT-qPCR idealnya harus dirancang untuk menjangkau persimpangan ekson-ekson, di mana primer amplifikasi berpotensi menjangkau batas ekson-intron yang sebenarnya.Karena sekuens DNA genom yang mengandung intron tidak diamplifikasi, desain ini mengurangi risiko positif palsu yang diamplifikasi dari kontaminasi DNA genom.

Jika primer tidak dapat dirancang untuk memisahkan ekson atau batas ekson-ekson, mungkin perlu memperlakukan sampel RNA dengan DNase I atau dsDNase bebas RNase untuk menghilangkan kontaminasi DNA genomik.

Kontrol RT-qPCR

Kontrol negatif transkripsi balik (kontrol -RT) harus disertakan dalam semua percobaan RT-qPCR untuk mendeteksi kontaminasi DNA (seperti DNA genomik atau produk PCR dari reaksi sebelumnya).Kontrol ini berisi semua komponen reaksi kecuali reverse transcriptase.Karena transkripsi terbalik tidak terjadi dengan kontrol ini, jika amplifikasi PCR diamati, kemungkinan besar kontaminasi dari DNA.


Waktu posting: 02-Agu-2022