COVID-19 adalah penyakit menular yang disebabkan oleh Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus Tipe 2. Ketika seseorang terinfeksi, gejala yang paling umum adalah demam, batuk, dan sesak napas.
Sampel yang digunakan untuk pengujian dapat diambil dengan swab nasofaring atau swab orofaring.
Metode standar deteksi coronavirus adalah reaksi berantai polimerase, PCR.Ini adalah metode yang banyak digunakan dalam biologi molekuler.Itu dapat dengan cepat menyalin jutaan hingga miliaran fragmen DNA tertentu.
Virus corona baru mengandung genom RNA beruntai tunggal yang sangat panjang.Untuk mendeteksi virus ini dengan PCR, molekul RNA harus diubah menjadi sekuens DNA komplementernya dengan reverse transcriptase, dan kemudian DNA yang baru disintesis dapat diamplifikasi dengan prosedur PCR standar, yang umumnya dikenal sebagai RT-PCR.
proses RT-PCR
ekstraksi RNA
Untuk melakukan metode ini, RNA virus pada dasarnya harus diekstraksi.Berbagai kit pemurnian RNA dapat digunakan untuk pemisahan yang nyaman, cepat, dan efektif.
Untuk mengekstrak RNA virus menggunakan kit komersial, pertama-tama tambahkan sampel ke tabung mikrosentrifus dan kemudian campurkan dengan buffer lisis.Buffer ini sangat terdenaturasi dan biasanya terdiri dari fenol dan guanidin isotiosianat.Selain itu, penghambat RNase biasanya ada dalam buffer lisis untuk memastikan isolasi RNA virus utuh.
Setelah menambahkan buffer lisis, vortex tabung pencampur dengan pulsa dan inkubasi pada suhu kamar.Virus kemudian dilisiskan dalam kondisi denaturasi tinggi yang disediakan oleh buffer lisis.
Setelah sampel dilisiskan, tabung centrifuge digunakan untuk prosedur pemurnian.Sampel dimasukkan ke dalam tabung centrifuge dan kemudian disentrifugasi.
Prosedur ini merupakan metode ekstraksi fase padat dimana fase diam terdiri dari matriks gel silika.
Di bawah kondisi garam dan pH yang optimal, molekul RNA berikatan dengan membran silika.
Pada saat yang sama, protein dan kontaminan lainnya dihilangkan.
Setelah sentrifugasi, masukkan tabung sentrifus ke dalam tabung pengumpul yang bersih, buang filtratnya, lalu tambahkan bufer pencuci.
Tempatkan tabung di centrifuge lagi untuk memaksa buffer pencuci melewati membran.Ini akan menghilangkan semua kotoran yang tersisa dari membran, hanya menyisakan RNA yang terikat pada gel silika.
Setelah sampel dicuci, masukkan tabung ke dalam tabung microcentrifuge yang bersih dan tambahkan buffer elusi.
Kemudian disentrifugasi untuk memaksa buffer elusi melalui membran.Buffer elusi menghilangkan RNA virus dari kolom spin dan memperoleh RNA murni yang bebas dari protein, inhibitor, dan kontaminan lainnya.
Konsentrat campuran
Setelah mengekstraksi RNA virus, langkah selanjutnya adalah menyiapkan campuran reaksi untuk amplifikasi PCR.Pada langkah ini, konsentrat digunakan.Larutan pekat ini adalah larutan pekat pracampur yang terdiri dari pracampur, transkriptase balik, nukleotida, primer maju, primer balik, probe TaqMan, dan DNA polimerase.
Terakhir, untuk melengkapi campuran reaksi ini, templat RNA ditambahkan.Tabung dicampur dengan pusaran pulsa, dan kemudian campuran reaksi dimasukkan ke dalam pelat PCR.Pelat PCR biasanya berisi 96 sumur dan dapat menganalisis beberapa sampel sekaligus.
amplifikasi PCR
Selanjutnya, letakkan pelat di mesin PCR, yang pada dasarnya adalah thermal cycler.
RT-PCR real-time digunakan untuk mendeteksi novel coronavirus 2019 dengan memperkuat urutan target pada gen RdrRP, gen E dan gen N.Pilihan gen target tergantung pada urutan primer dan probe.
Langkah pertama RT-PCR adalah transkripsi terbalik.Untai pertama DNA komplementer disintesis, yang diprakarsai oleh primer terbalik PCR, yang berikatan dengan bagian komplementer genom RNA virus.Kemudian reverse transcriptase menambahkan nukleotida DNA ke ujung 3 primer untuk mensintesis DNA yang melengkapi RNA virus.Suhu dan durasi langkah ini bergantung pada primer, target RNA, dan reverse transcriptase yang digunakan.
Selanjutnya, langkah denaturasi awal diterapkan, yang menghasilkan denaturasi hibrid RNA-DNA.Langkah ini diperlukan untuk mengaktifkan DNA polimerase.Pada saat yang sama, reverse transcriptase tidak aktif.
PCR terdiri dari serangkaian siklus termal.Setiap siklus terdiri dari langkah denaturasi, anil, dan ekstensi.
Langkah denaturasi melibatkan pemanasan ruang reaksi hingga 95 derajat Celcius dan menggunakannya untuk denaturasi templat DNA beruntai ganda.
Pada langkah berikutnya, suhu reaksi dikurangi menjadi 58 derajat Celcius, memungkinkan primer maju untuk dianil ke bagian komplementer dari cetakan DNA beruntai tunggal.Suhu anil secara langsung tergantung pada panjang dan komposisi primer.
Pada langkah ekstensi, DNA polimerase mensintesis untai DNA baru yang melengkapi untai cetakan DNA.Dengan menambahkan inti bebas komplementer ke templat dalam arah 5′ ke 3′ dari campuran reaksi.Suhu langkah ini tergantung pada DNA polimerase yang digunakan.
Setelah siklus pertama, target DNA beruntai ganda diperoleh.
Kemudian, masuk ke siklus kedua.DNA beruntai ganda didenaturasi untuk menghasilkan dua molekul DNA beruntai tunggal.
Pada langkah selanjutnya, suhu reaksi diturunkan, primer dianil ke setiap templat DNA beruntai tunggal, dan probe Taq-man dianil ke bagian komplementer dari DNA target.
Probe TaqMan terdiri dari fluorophore yang terhubung secara kovalen dengan ujung 5′ dari probe oligonukleotida.Saat gembira dengan sumber cahaya pengendara sepeda, fluorofor memancarkan fluoresensi.Selain itu, probe terdiri dari quencher di ujung 3′.Kedekatan gen reporter dengan quencher mencegah deteksi fluoresensi.
Pada langkah ekstensi, DNA polimerase mensintesis untai baru.Ketika polimerase mencapai probe TaqMan, aktivitas 5'nuclease endogen membelah probe, memisahkan pewarna dari quencher.
Dengan setiap siklus PCR, lebih banyak molekul pewarna dilepaskan, menghasilkan peningkatan intensitas fluoresensi sebanding dengan jumlah amplikon yang disintesis.
Metode ini memungkinkan untuk memperkirakan jumlah urutan tertentu yang ada dalam sampel.Jumlah fragmen DNA beruntai ganda menjadi dua kali lipat dalam setiap siklus.Oleh karena itu, PCR dapat digunakan untuk menganalisis sampel yang sangat kecil.
Untuk mengukur sinyal fluoresen, lampu halogen tungsten, filter eksitasi, reflektor, lensa, filter emisi, dan kamera CCD yang menggunakan perangkat yang dipasangi muatan.
LANGKAH 4 Deteksi
Untuk mengukur sinyal fluoresen, lampu halogen tungsten, filter eksitasi, reflektor, lensa, filter emisi, dan kamera CCD yang menggunakan perangkat yang dipasangi muatan.
Cahaya yang disaring dari lampu dipantulkan oleh reflektor, melewati lensa kondensor, dan difokuskan ke tengah setiap lubang.Kemudian fluoresensi yang dipancarkan dari lubang dipantulkan dari cermin, melewati filter emisi, dan dideteksi oleh kamera CCD.Dalam setiap siklus PCR, cahaya fluorophore yang tereksitasi sendiri dapat dideteksi oleh CCD.
Ini mengubah cahaya yang ditangkap menjadi data digital.Metode ini disebut real-time PCR, dan memungkinkan pemantauan real-time dari kemajuan reaksi PCR.
Waktu posting: Jul-19-2021