Beberapa penemuan revolusioner dalam sejarah teknologi deteksi menurut saya adalah teknologi immunolabeling berdasarkan prinsip pengikatan spesifik antigen-antibodi, teknologi PCR dan teknologi sekuensing.Hari ini kita akan berbicara tentang teknologi PCR.Menurut evolusi teknologi PCR, orang biasanya membagi teknologi PCR menjadi tiga generasi: teknologi PCR biasa, teknologi PCR kuantitatif fluoresen waktu nyata, dan teknologi PCR digital.
Cteknik PCR umum
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis menemukan reaksi berantai polimerase (polymerase chain reaction, PCR) pada tahun 1983. Dikatakan bahwa ketika dia sedang mengemudikan pacarnya, dia tiba-tiba mendapat inspirasi dan pemikiran tentang prinsip PCR (tentang manfaat mengemudi).Kary Mullis dianugerahi Hadiah Nobel Kimia pada tahun 1993. The New York Times berkomentar: "Sangat orisinal dan signifikan, hampir membagi biologi menjadi era pra-PCR dan pasca-PCR.
Prinsip PCR: Di bawah katalisis DNA polimerase, DNA untai induk digunakan sebagai templat, dan primer spesifik digunakan sebagai titik awal ekstensi, dan DNA untai anak yang melengkapi DNA templat untai induk disalin secara in vitro melalui denaturasi, anil, ekstensi, dan langkah-langkah lainnya.Ini adalah teknologi amplifikasi sintesis DNA in vitro, yang dapat dengan cepat dan spesifik memperkuat DNA target apa pun secara in vitro.
Keuntungan PCR biasa
1.Metode klasik, standar internasional dan domestik lengkap
2.Biaya reagen instrumen yang lebih rendah
3.Produk PCR dapat dipulihkan untuk percobaan biologi molekuler lainnya
Mesin PCR Foregene yang direkomendasikan: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Produk terkait: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Kerugian dari PCR biasa
1.mudah tercemar
2.operasi yang rumit
3.analisis kualitatif saja
4.Sensitivitas sedang
5.Ada amplifikasi non-spesifik, dan ketika pita non-spesifik berukuran sama dengan pita target, tidak dapat dibedakan
CPCR berbasis elektroforesis apiler
Menanggapi kekurangan PCR biasa, beberapa produsen telah memperkenalkan instrumen berdasarkan prinsip elektroforesis kapiler.Langkah elektroforesis setelah amplifikasi PCR selesai di kapiler.Sensitivitasnya lebih tinggi, dan perbedaan beberapa basis dapat dibedakan dan amplifikasi dapat dihitung oleh MAERKER.konten produk.Kerugiannya adalah produk PCR masih perlu dibuka dan dimasukkan ke dalam alat, dan masih ada risiko kontaminasi yang besar.
CapilerEelektroforesis
2. Teknologi PCR kuantitatif fluoresen real-time (Quantitative Real-time PCR, qPCR).PCR kuantitatif fluoresen, juga disebut Real-Time PCR, adalah teknologi kuantitatif asam nukleat baru yang dikembangkan oleh PE (Perkin Elmer) pada tahun 1995. Sejarah perkembangan PCR kuantitatif fluoresen adalah sejarah perjuangan yang menggetarkan jiwa para raksasa seperti ABI, Roche, dan Bio-Rad.Jika Anda tertarik, Anda dapat memeriksanya.Teknik ini saat ini merupakan teknik PCR semi-kuantitatif yang paling matang dan banyak digunakan.
Mesin qPCR yang disarankan: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metode pewarna fluoresen (SYBR Green I):SYBR Green I adalah pewarna pengikat DNA yang paling umum digunakan untuk PCR kuantitatif, yang mengikat DNA beruntai ganda secara non-spesifik.Dalam keadaan bebas, SYBR Green memancarkan fluoresensi lemah, tetapi begitu terikat pada DNA beruntai ganda, fluoresensinya meningkat 1000 kali lipat.Oleh karena itu, total sinyal fluoresen yang dipancarkan oleh suatu reaksi sebanding dengan jumlah DNA beruntai ganda yang ada dan akan meningkat dengan bertambahnya produk yang diamplifikasi.Karena pewarna mengikat DNA beruntai ganda secara non-spesifik, hasil positif palsu dapat dihasilkan.
Produk terkait: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metode probe fluoresen (teknologi Taqman): SelamaAmplifikasi PCR, probe fluoresen spesifik ditambahkan bersamaan dengan sepasang primer.Probe adalah oligonukleotida linier, dengan kelompok reporter fluoresen dan kelompok pemadam fluoresen masing-masing diberi label di kedua ujungnya.Ketika probe utuh, sinyal fluoresen yang dipancarkan oleh kelompok pelapor diserap oleh kelompok pemadam, dan deteksi Tidak ada sinyal fluoresen;selama amplifikasi PCR (pada tahap ekstensi), aktivitas Pemain Dadu 5'-3 'dari enzim Taq akan mencerna dan menurunkan probe, sehingga kelompok fluoresen reporter dan kelompok fluoresen quencher dipisahkan, sehingga sistem pemantauan fluoresensi Sinyal fluoresen dapat diterima, yaitu, setiap kali rantai DNA diamplifikasi, molekul fluoresen terbentuk, yang mewujudkan sinkronisasi lengkap dari akumulasi sinyal fluoresen dan pembentukan produk PCR.Metode probe Taqman merupakan metode deteksi yang paling umum digunakan dalam deteksi klinis.
Produk terkait: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Keuntungan dari qPCR
1.Metodenya sudah matang dan peralatan serta reagen pendukungnya sudah lengkap
2.Biaya reagen sedang
3.mudah digunakan
4.Sensitivitas dan spesifisitas deteksi tinggi
Kerugian dari qPCR
Mutasi gen target menyebabkan deteksi yang terlewatkan.
Hasil deteksi template konsentrasi rendah tidak dapat ditentukan.
Ada kesalahan besar saat menggunakan kurva standar untuk deteksi kuantitatif.
3. Teknologi PCR digital (PCR digital, dPCR).
PCR digital adalah teknik untuk kuantifikasi absolut molekul asam nukleat.Dibandingkan dengan qPCR, PCR digital dapat langsung membaca jumlah molekul DNA/RNA, yang merupakan kuantifikasi mutlak molekul asam nukleat dalam sampel awal.Pada tahun 1999, Bert Vogelstein dan Kenneth W. Kin-zler secara resmi mengusulkan konsep dPCR.
Pada tahun 2006, Fluidigm adalah yang pertama memproduksi instrumen dPCR berbasis chip komersial.Pada tahun 2009, Life Technologies meluncurkan sistem dPCR OpenArray dan QuantStudio 12K Flex.Pada tahun 2013, Life Technologies meluncurkan sistem QuantStudio 3DdPCR, yang menggunakan teknologi chip mikofluida berskala nano berdensitas tinggi untuk mendistribusikan sampel secara merata ke 20.000 sel individu.dalam reaksi dengan baik.
Pada tahun 2011, Bio-Rad meluncurkan instrumen dPCR QX100 berbasis tetesan, yang menggunakan teknologi air dalam minyak untuk mendistribusikan sampel secara merata ke 20.000 tetesan air dalam minyak, dan menggunakan penganalisa tetesan untuk menganalisis tetesan.Pada tahun 2012, RainDance meluncurkan instrumen RainDrop dPCR, digerakkan oleh gas bertekanan tinggi, untuk membagi setiap sistem reaksi standar menjadi emulsi reaksi yang mengandung 1 juta hingga 10 juta tetesan mikro tingkat pikoliter.
Sejauh ini, PCR digital telah membentuk dua faksi besar, tipe chip dan tipe droplet.Apa pun jenis PCR digital, prinsip intinya adalah pengenceran terbatas, PCR titik akhir, dan distribusi Poisson.Sistem reaksi PCR standar yang mengandung templat asam nukleat dibagi secara merata menjadi puluhan ribu reaksi PCR, yang didistribusikan ke chip atau mikrodroplet, sehingga setiap reaksi mengandung molekul templat sebanyak mungkin, dan reaksi PCR templat molekul tunggal dilakukan.Dengan membaca fluoresensi Kehadiran atau ketidakhadiran sinyal dihitung, dan kuantifikasi absolut dilakukan setelah kalibrasi distribusi Poisson statistik.
Berikut karakteristik dari beberapa platform PCR digital yang pernah saya gunakan:
1. Bio-Rad QX200 droplet digital PCR Bio-RadQX200 adalah platform PCR digital yang sangat klasik, proses deteksi dasar: 20.000 sampel dihasilkan oleh generator tetesan Tetesan mikro air dalam minyak diamplifikasi pada mesin PCR biasa, dan akhirnya sinyal fluoresensi setiap tetesan mikro dibaca oleh pembaca tetesan mikro.Pengoperasiannya lebih rumit, dan risiko polusi sedang.
PCR digital mikro-tetesan Xinyi TD1Xinyi TD1 adalah platform PCR digital domestik, proses deteksi dasar: menghasilkan 30.000-50.000 tetesan air dalam minyak melalui generator tetesan, memperkuat instrumen PCR umum, dan akhirnya lulus Pembaca tetesan membaca sinyal fluoresen dari setiap tetesan.Pembuatan tetesan dan pembacaan di platform ini dilakukan dalam chip khusus dengan risiko kontaminasi yang rendah.
STILLA Naica chip mikro-tetesan PCR digitalSTILLA Naica adalah platform PCR digital yang relatif baru.Proses pendeteksian dasarnya adalah: tambahkan larutan reaksi ke dalam chip, masukkan chip ke dalam sistem pembangkit dan amplifikasi mikro-tetesan, dan hasilkan 30.000 tetesan mikro.Sebarkan pada chip, dan amplifikasi PCR selesai pada chip.Kemudian chip yang diperkuat ditransfer ke sistem analisis pembacaan tetesan mikro, dan sinyal fluoresen dibaca dengan mengambil gambar.Karena seluruh proses berlangsung dalam chip tertutup, risiko kontaminasi rendah.
4. PCR digital chip ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D adalah platform PCR digital berbasis chip klasik lainnya.Proses pendeteksian dasarnya adalah: tambahkan larutan reaksi ke dalam penyebar, dan sebarkan larutan reaksi secara merata pada chip dengan 20.000 lubang mikro melalui penyebar., pasang chip pada mesin PCR untuk memperkuat, dan terakhir masukkan chip ke pembaca dan ambil foto untuk membaca sinyal fluoresen.Pengoperasiannya relatif rumit, dan seluruh proses dilakukan dalam chip tertutup, dan risiko kontaminasi rendah.
5. JN MEDSYS Kejelasan chip digital PCR
JN MEDSYS Clarity adalah platform PCR digital tipe chip yang relatif baru.Proses pendeteksian dasarnya adalah: menambahkan larutan reaksi ke dalam aplikator, dan menyebarkan larutan reaksi secara merata pada 10.000 tabung PCR yang dipasang di dalam tabung PCR melalui aplikator.Pada chip mikro, larutan reaksi masuk ke dalam chip melalui aksi kapiler, dan tabung PCR dengan chip tersebut ditempatkan pada mesin PCR untuk amplifikasi, dan terakhir chip dimasukkan ke dalam reader untuk membaca sinyal fluoresen dengan mengambil foto.Operasi lebih rumit.Risiko kontaminasi rendah.
Parameter dari setiap platform PCR digital dirangkum sebagai berikut:
Indikator evaluasi platform PCR digital adalah: jumlah unit split, jumlah saluran fluoresen, kompleksitas operasi, dan risiko kontaminasi.Namun yang terpenting adalah akurasi pendeteksiannya.Salah satu cara untuk mengevaluasi platform PCR digital adalah dengan menggunakan beberapa platform PCR digital untuk memverifikasi satu sama lain, dan cara lain adalah dengan menggunakan zat standar dengan nilai yang akurat.
Keuntungan dPCR
1.Mencapai kuantifikasi absolut
2.Sensitivitas dan spesifisitas lebih tinggi
3.Dapat mendeteksi sampel salinan rendah
Kekurangan dPCR1. Peralatan dan reagen yang mahal 2. Pengoperasian yang rumit dan waktu deteksi yang lama 3. Jangkauan deteksi yang sempit
Saat ini, tiga generasi teknologi PCR memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing, dan masing-masing memiliki bidang aplikasinya sendiri, dan bukan hubungan yang satu generasi menggantikan yang lain.Kemajuan teknologi yang berkelanjutan telah menyuntikkan vitalitas baru ke dalam teknologi PCR, memungkinkannya untuk membuka satu arah aplikasi demi satu, membuat deteksi asam nukleat lebih nyaman dan akurat.
Sumber: Dr. Yuan membawa Anda untuk pengujian
Produk yang direkomendasikan:
Waktu posting: Nov-18-2022
