• facebook
  • linkedin
  • Youtube

1. Deteksi absorbansi larutan RNA

Absorbansi pada 280, 320, 230, dan 260 nm masing-masing mewakili nilai asam nukleat, latar belakang (kekeruhan larutan), konsentrasi garam, dan bahan organik seperti protein.Umumnya hanya melihat OD260/OD280 (Rasio, R).Ketika 1,8 ~ 2,0, kami berpikir bahwa kontaminasi protein atau bahan organik lainnya dalam RNA dapat ditoleransi, tetapi perlu dicatat bahwa ketika Tris digunakan sebagai buffer untuk mendeteksi absorbansi, nilai R mungkin lebih besar dari 2 (umumnya harus <2,2).Ketika R<1,8, pencemaran protein atau bahan organik lainnya dalam larutan lebih jelas, dan nasib RNA dapat ditentukan sesuai kebutuhan.Ketika R>2.2, berarti RNA telah terhidrolisis menjadi asam nukleat tunggal.
 
2. Pola elektroforesis RNA
Umumnya, gel denaturasi digunakan untuk elektroforesis RNA, tetapi jika hanya untuk mendeteksi kualitas RNA, gel denaturasi tidak diperlukan, dan gel agarosa biasa dapat digunakan.Tujuan elektroforesis adalah untuk mendeteksi integritas pita 28S dan 18S dan rasionya, atau integritas smear mRNA.Secara umum, jika pita 28S dan 18S cerah, jernih, dan tajam (mengacu pada tepi pita yang jelas), dan kecerahan 28S lebih dari dua kali pita 18S, kami menganggap kualitas RNA bagus.
Di atas adalah dua metode yang biasa kami gunakan, tetapi tidak satu pun dari kedua metode ini yang dapat memberi tahu kami dengan jelas apakah ada sisa RNase dalam larutan RNA.Jika ada sejumlah kecil RNase dalam larutan, sulit bagi kami untuk mendeteksinya dengan metode di atas, tetapi sebagian besar reaksi enzimatik selanjutnya dilakukan pada suhu di atas 37 derajat dan untuk waktu yang lama.Dengan cara ini, jika jumlah RNase dalam larutan RNA sangat sedikit, maka akan ada lingkungan dan waktu yang sangat cocok untuk memainkan perannya dalam percobaan selanjutnya, dan tentu saja percobaan akan menjadi dingin saat ini.Di bawah ini kami memperkenalkan metode yang dapat mengonfirmasi apakah ada residu RNase dalam larutan RNA.
 
3. Uji pelestarian panas
Menurut konsentrasi sampel, ambil dua 1000 ng RNA dari larutan RNA dan tambahkan ke tabung sentrifus 0,5 ml, dan tambahkan dengan buffer pH 7,0 Tris hingga total volume 10 ul, lalu tutup tutup tabung.Masukkan salah satunya ke dalam penangas air bersuhu konstan 70°C dan jaga agar tetap hangat selama 1 jam.Bagian lainnya disimpan dalam lemari pendingin -20°C selama 1 jam.Saat waktunya habis, keluarkan kedua sampel untuk elektroforesis.Setelah elektroforesis selesai, bandingkan pita elektroforesis keduanya.Jika pita keduanya konsisten atau tidak memiliki perbedaan yang signifikan (tentunya pita mereka juga memenuhi syarat pada metode 2), berarti tidak ada sisa kontaminasi RNase pada larutan RNA, dan kualitas RNA sangat baik.Sebaliknya, jika sampel yang diinkubasi pada suhu 70°C menunjukkan degradasi yang nyata, hal ini menunjukkan adanya kontaminasi RNase pada larutan RNA.
 
2 Metode dan teknik eksperimental untuk ekstraksi RNA
Masalah yang sering kita temui saat mengekstraksi RNA adalah: (1) Rendemen RNA rendah;(2) RNA memiliki polusi garam yang serius;(3) RNA memiliki polusi pelarut organik yang serius;(4) degradasi sampel dan masalah lainnya
 
1. Reagen ekstraksi RNA total yang umum digunakan
Metode guanidine isothiocyanate dan metode Trizol adalah metode yang paling umum digunakan untuk ekstraksi RNA total dari jaringan hewan dan sel hewan.Ini sangat cocok untuk sampel kecil dan jaringan yang sangat sulit diekstraksi, seperti ekstraksi RNA total dari kulit kelinci dan jaringan ikat hewan;selain itu, Trizol, sebagai reagen lisis serba guna, juga dapat digunakan untuk ekstraksi jaringan tanaman, bakteri, jamur, dan jaringan lainnya.Untuk jaringan tanaman yang mengandung polisakarida dan polifenol, seperti kamelia oleifera, daun teh, rapeseed, dll., metode CTAB juga dapat digunakan untuk mengekstraksi RNA total.

Sebagai metode konvensional, metode kolom ganda juga sangat populer karena operasi suhu normalnya, tidak perlu menambahkan RNase, dan aman—tidak ada kloroform, fenol, dan reagen organik lainnya untuk ekstraksi.(produk yang direkomendasikan )

1
2

2. Ekstraksi total RNA dari jaringan hewan
 
(1) Cobalah untuk memilih jaringan segar, jika tidak segar (sebaiknya dalam waktu tiga bulan - lemari es 80 ℃ atau beku dalam nitrogen cair. Saat memotong jaringan, jangan memotong langsung pada suhu kamar, pastikan untuk meletakkannya di kotak es, cobalah untuk menghindari pembekuan dan pencairan berulang.
(2) Gunakan gunting bersih dan pinset untuk memotong sepotong kecil jaringan, coba potong bagian tengah jaringan saat memotong sampel, atau potong dulu jaringan besar dari tengah, lalu potong sampel pada posisi sayatan baru.Jaringan yang diangkat harus diparut sepenuhnya, masukkan jaringan yang diparut ke dalam tabung EP tanpa RNase, tambahkan lisat, jaringan yang diparut harus diekspos sepenuhnya ke lisat, dan siapkan untuk homogenisasi.

(3) Untuk jaringan normal, pilih jaringan seukuran kacang hijau (30-60 mg) untuk homogenisasi.Jika jaringan mengandung banyak protein, lemak, atau jaringan berserat padat seperti hati, tingkatkan atau kurangi jumlah jaringan yang dipotong dengan tepat (opsional) Pilih 10~20 mg).
(4) Jika otot ikan, daging udang, ubur-ubur dan jaringan lain dengan kadar air tinggi diekstraksi, volume sampel harus ditingkatkan secara tepat (disarankan 100-200 mg).
(5) Jika kondisi memungkinkan, jaringan hewan dapat langsung diekstraksi setelah dihomogenisasi dengan alat penghomogen jaringan aliran tinggi, jika tidak ada peralatan tersebut.
(6) RNA yang diperoleh setelah ekstraksi akhir harus segera ditempatkan di kotak es untuk mengurangi degradasi RNA.

3. Ekstraksi RNA sel hewan

(1) Sel suspensi: centrifuge langsung dan buang medianya, cuci dengan PBS steril selama 1-2 kali, lalu suspensikan dengan PBS dalam jumlah yang sesuai, lalu tambahkan lisat untuk lisis.Jangan menambahkan lisat langsung ke sel yang diendapkan setelah cairannya benar-benar dibuang.Hal ini akan menyebabkan paket histon dilepaskan setelah sel lisis pada lapisan luar menempel di bagian luar sel yang diendapkan, sehingga membatasi kontak sel di dalam pelet dengan lisat., menghasilkan lisis sel yang tidak lengkap dan mengurangi hasil RNA.

(2) Sel yang semi-adheren atau tidak melekat erat: Setelah media dibuang, cuci dengan PBS selama 1-2 kali, kemudian langsung serap PBS dalam jumlah yang sesuai dan tiup cawan kultur dengan pipet atau pistol untuk meledakkan sel, dan pindahkan ke sel bebas RNA.Tambahkan lisat ke tabung EP enzim untuk ekstraksi.

(3) Sel-sel yang melekat: perlu dicerna dengan trypsin terlebih dahulu, kemudian dikumpulkan ke dalam tabung EP bebas RNase, disentrifugasi untuk menghilangkan supernatan, dicuci 1-2 kali dengan PBS untuk menghilangkan tripsin berlebih, dan disuspensikan kembali dengan jumlah PBS yang sesuai Kemudian lanjutkan ke langkah ekstraksi.

4. Ekstraksi RNA tanaman

Jaringan tanaman kaya akan senyawa fenolik, atau kaya polisakarida, atau mengandung beberapa metabolit sekunder yang tidak teridentifikasi, atau memiliki aktivitas RNase yang tinggi.Zat-zat ini bergabung erat dengan RNA setelah lisis sel untuk membentuk kompleks yang tidak larut atau endapan koloid, yang sulit dihilangkan.Oleh karena itu, saat kita mengekstraksi jaringan tumbuhan, kita perlu memilih kit untuk tumbuhan.Lisat dalam kit dapat secara efektif memecahkan masalah oksidasi mudah polifenol dan pemisahan senyawa polisakarida dan asam nukleat.

(Untuk ekstraksi RNA tanaman polisakarida polifenol, produk yang direkomendasikan:

(1) Kulit, daging buah, biji, daun, dll. tanaman harus ditumbuk seluruhnya dalam mortar.Selama proses penggilingan, nitrogen cair harus diisi ulang tepat waktu untuk menghindari pelelehan sampel.Sampel tanah harus segera ditambahkan ke lisat dan dikocok untuk menghindari degradasi RNA.

(2) Untuk sampel yang kaya serat seperti beras dan daun gandum, jumlah ekstraksi harus dikurangi dengan tepat, jika tidak, penggilingan dan lisis jaringan tidak akan selesai, menghasilkan hasil RNA yang diekstraksi rendah.

(3) Untuk jaringan tanaman dengan kandungan air yang tinggi, seperti buah delima, buah semangka, buah persik, dll., ukuran sampel harus ditingkatkan secara tepat (100-200 mg adalah opsional).

(4) Jaringan tanaman, seperti daun tanaman, rimpang, buah keras dan bahan lainnya umumnya direkomendasikan untuk menggunakan nitrogen cair untuk mengaduk bahan secara menyeluruh dalam mortar, dan kemudian melanjutkan ke langkah ekstraksi.Homogenizer jaringan konvensional mungkin tidak efektif dalam menyeragamkan jaringan tanaman, dan umumnya tidak direkomendasikan.

5. Tindakan pencegahan untuk ekstraksi RNA

(1) Sampel jaringan harus sesegar mungkin untuk menghindari pembekuan dan pencairan berulang.

(2) Jaringan harus digiling seluruhnya selama ekstraksi, dan jumlah jaringan tidak boleh terlalu sedikit, apalagi terlalu banyak.

(3) Waktu inkubasi yang cukup harus diberikan setelah menambahkan lisat untuk melisiskan sampel sepenuhnya.

(4) Ketika menggunakan metode Trizol untuk ekstraksi, prinsip menyerap supernatan setelah stratifikasi adalah "lebih suka menghirup lebih sedikit daripada menghirup lebih banyak", dan tidak boleh mengekstraksi ke lapisan tengah, jika tidak maka akan menyebabkan kontaminasi DNA genomik yang serius.

(5) Saat mencuci, cairan pencuci harus sepenuhnya menyusup ke sekeliling dinding tabung untuk memastikan pencucian menyeluruh.

(6) Untuk metode ekstraksi kolom, selain memisahkan kolom setelah dicuci, kolom adsorpsi juga harus ditempatkan di bangku yang sangat bersih dan ditiup selama 5-10 menit untuk menguapkan pelarut organik sepenuhnya hingga kering.

(7) Pada elusi terakhir dari metode kolom, setelah menambahkan air DEPC, harus diinkubasi selama 3-5 menit, atau air DEPC harus dipanaskan terlebih dahulu hingga 60°C untuk meningkatkan hasil elusi.Dalam metode pembelahan Trizol dan pengendapan isopropanol tradisional, RNA akhir dilarutkan dalam air DEPC, sehingga waktu yang tepat harus diberikan untuk pembubaran, dan bagian bawah tabung sentrifus harus terus menerus ditiup dengan ujung pipet.

3 Three Penyebab dan solusi untuk konsentrasi RNA rendah/kualitas buruk
 
1. Hasil terlalu rendah
Sampel yang diekstrak terlalu sedikit, jumlah totalnya tidak mencukupi, atau sampel yang diekstraksi terlalu banyak dan lisisnya tidak lengkap;jaringan atau sel dengan kualitas yang sesuai harus digunakan untuk ekstraksi, pre-treatment sampel harus dilakukan dengan baik, dan lisis harus memadai.
 
2. Residu genom
Saat mengekstraksi dengan metode Trizol, ketika supernatan tersedot ke lapisan tengah setelah pelapisan, akan menyebabkan kontaminasi genom yang serius;kehati-hatian ekstra harus diberikan saat melapisi untuk menghindari pengisapan ke lapisan tengah.Jika metode kolom digunakan untuk ekstraksi, kit yang berisi DNase I dapat dipilih untuk ekstraksi.Asam nukleat yang teradsorpsi pada membran langsung dicerna dengan DNase I, yang dapat sangat mengurangi residu DNA.
 
3. Degradasi RNA
Mungkin degradasi sampel yang diekstraksi itu sendiri, atau degradasi yang disebabkan selama proses ekstraksi;sejauh mungkin, sampel segar harus digunakan untuk ekstraksi RNA, dan sampel yang dikumpulkan harus disimpan dalam nitrogen cair atau lemari es -80 ° C tepat waktu, dan pembekuan dan pencairan berulang harus dihindari.Tip bebas RNase/DNase, tabung sentrifus, dan bahan lain harus digunakan dalam proses ekstraksi RNA.Proses ekstraksi harus secepat mungkin.RNA yang diekstraksi harus ditempatkan di kotak es dan disimpan pada suhu -80 tepat waktu.Jika RNA yang diekstraksi perlu dideteksi dengan elektroforesis gel, elektroforesis harus dilakukan segera setelah ekstraksi, dan penyangga elektroforesis harus diganti dengan yang baru disiapkan.
 
4. Residu garam dan pelarut organik
Reagen ekstraksi mengandung garam fenol dan guanidin, dan larutan pencuci mengandung etanol.Selama proses ekstraksi, lisat tidak sepenuhnya diserap dan dibuang, dan larutan pencuci tidak sepenuhnya kering.Garam residu dan pelarut organik berbahaya bagi transkripsi balik dan PCR selanjutnya.Tingkat penghambatan yang berbeda, sehingga lisat jaringan harus dihilangkan sepenuhnya selama proses ekstraksi, dan pencucian harus cukup sehingga dinding tabung di sekitarnya dapat dicuci.Selain itu, tabung dikosongkan dan ditiup merupakan langkah yang diperlukan, yang selanjutnya akan mengurangi residu bahan organik.
 
Untuk informasi lebih lanjut tentang ekstraksi RNA, silakan ikuti situs web kami:
www.foreivd.com untuk informasi lebih lanjut.

7

Waktu posting: 01-Des-2022