Teknologi diagnosis molekuler menggunakan metode biologi molekuler untuk mendeteksi ekspresi dan struktur materi genetik tubuh manusia dan berbagai patogen, sehingga dapat mencapai tujuan prediksi dan diagnosis penyakit.

Dalam beberapa tahun terakhir, dengan peningkatan dan iterasi teknologi diagnostik molekuler, aplikasi klinis diagnostik molekuler menjadi semakin luas dan mendalam, dan pasar diagnostik molekuler telah memasuki periode perkembangan pesat.

Penulis merangkum teknologi diagnostik molekuler yang umum di pasaran, dan dibagi menjadi tiga bagian: bagian pertama memperkenalkan teknologi PCR, bagian kedua memperkenalkan teknologi amplifikasi isotermal asam nukleat, dan bagian kedua memperkenalkan teknologi pengurutan.

01

Bagian I: Teknologi PCR

teknologi PCR

PCR (polymerase chain reaction) adalah salah satu teknologi amplifikasi DNA in vitro, dengan sejarah lebih dari 30 tahun.

Teknologi PCR dirintis pada tahun 1983 oleh Kary Mullis dari Cetus, USA.Mullis mengajukan paten PCR pada tahun 1985 dan menerbitkan makalah akademik PCR pertama tentang Sains pada tahun yang sama.Mullis memenangkan Hadiah Nobel Kimia pada tahun 1993.

Prinsip Dasar PCR

PCR dapat memperkuat fragmen DNA target lebih dari satu juta kali.Prinsipnya adalah bahwa di bawah katalisis DNA polimerase, DNA untai induk digunakan sebagai templat, dan primer spesifik digunakan sebagai titik awal untuk ekstensi.Ini direplikasi secara in vitro melalui langkah-langkah seperti denaturasi, anil, dan ekstensi.Proses DNA untai anak melengkapi DNA cetakan untai induk.

Proses PCR standar dibagi menjadi tiga langkah:

1. Denaturasi: Gunakan suhu tinggi untuk memisahkan untaian ganda DNA.Ikatan hidrogen antara untaian ganda DNA terputus pada suhu tinggi (93-98°C).

2. Annealing: Setelah DNA beruntai ganda dipisahkan, suhu diturunkan sehingga primer dapat berikatan dengan DNA beruntai tunggal.

3. Perpanjangan: DNA polimerase mulai mensintesis untaian komplementer di sepanjang untai DNA dari ikatan primer ketika suhu diturunkan.Ketika ekstensi selesai, siklus selesai, dan jumlah fragmen DNA menjadi dua kali lipat.

Mengulangi ketiga langkah ini 25-35 kali, jumlah fragmen DNA akan meningkat secara eksponensial.

Kecerdikan PCR adalah primer yang berbeda dapat dirancang untuk gen target yang berbeda, sehingga fragmen gen target dapat diamplifikasi dalam waktu singkat.

Selama ini PCR dapat dibagi menjadi tiga kategori, yaitu PCR biasa, PCR kuantitatif fluoresen, dan PCR digital.

PCR biasa generasi pertama

Gunakan instrumen amplifikasi PCR biasa untuk memperkuat gen target, lalu gunakan elektroforesis gel agarosa untuk mendeteksi produk, hanya analisis kualitatif yang dapat dilakukan.

Kerugian utama dari PCR generasi pertama:

-Rawan terhadap amplifikasi non-spesifik dan hasil positif palsu.

-Deteksi memakan waktu lama dan pengoperasiannya tidak praktis.

-Hanya pengujian kualitatif yang dapat dilakukan.

PCR kuantitatif fluoresensi generasi kedua

PCR kuantitatif fluoresensi (PCR Real-Time), juga dikenal sebagai qPCR, digunakan untuk memantau akumulasi produk yang diperkuat melalui akumulasi sinyal fluoresensi dengan menambahkan probe fluoresen yang dapat menunjukkan kemajuan sistem reaksi, dan untuk menilai hasil melalui kurva fluoresensi, dan dapat diukur dengan bantuan nilai Cq dan kurva standar.

Karena teknologi qPCR dilakukan dalam sistem tertutup, kemungkinan kontaminasi berkurang, dan sinyal fluoresensi dapat dipantau untuk deteksi kuantitatif, sehingga paling banyak digunakan dalam praktik klinis dan telah menjadi teknologi dominan dalam PCR.

Zat fluoresen yang digunakan dalam PCR kuantitatif fluoresen waktu-nyata dapat dibagi menjadi: probe fluoresen TaqMan, suar molekuler, dan pewarna fluoresen.

1) Probe neon TaqMan:

Selama amplifikasi PCR, probe fluoresen spesifik ditambahkan sambil menambahkan sepasang primer.Probe adalah oligonukleotida, dan kedua ujungnya masing-masing diberi label dengan kelompok fluoresen reporter dan kelompok fluoresen quencher.

Ketika probe utuh, sinyal fluoresen yang dipancarkan oleh kelompok reporter diserap oleh kelompok quenching;selama amplifikasi PCR, aktivitas exonuclease 5′-3′ dari enzim Taq membelah dan mendegradasi probe, membuat kelompok fluoresen reporter dan quencher.

2) Pewarna neon SYBR:

Dalam sistem reaksi PCR, kelebihan pewarna fluoresen SYBR ditambahkan.Setelah pewarna fluoresen SYBR secara non-spesifik dimasukkan ke dalam untai ganda DNA, ia memancarkan sinyal fluoresen.Molekul pewarna SYBR yang tidak dimasukkan ke dalam rantai tidak akan memancarkan sinyal fluoresen apa pun, sehingga memastikan sinyal fluoresen Peningkatan produk PCR sepenuhnya disinkronkan dengan peningkatan produk PCR.SYBR hanya berikatan dengan DNA beruntai ganda, sehingga kurva leleh dapat digunakan untuk menentukan apakah reaksi PCR spesifik.

3) Suar molekuler

Ini adalah probe oligonukleotida berlabel ganda batang-loop yang membentuk struktur jepit rambut sekitar 8 basa pada ujung 5 dan 3.Sekuens asam nukleat pada kedua ujung saling berpasangan, menyebabkan gugus fluoresen dan gugus quenching menjadi rapat.Tutup, itu tidak akan menghasilkan fluoresensi.

Setelah produk PCR dihasilkan, selama proses anil, bagian tengah suar molekul dipasangkan dengan sekuens DNA spesifik, dan gen fluoresen dipisahkan dari gen quencher untuk menghasilkan fluoresensi.

Kerugian utama PCR generasi kedua:

Sensitivitas masih kurang, dan pendeteksian spesimen salinan rendah tidak akurat.

Ada pengaruh nilai latar belakang, dan hasilnya rentan terhadap gangguan.

PCR digital generasi ketiga

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) menghitung nomor salinan urutan target melalui deteksi titik akhir, dan dapat melakukan deteksi kuantitatif absolut yang akurat tanpa menggunakan kontrol internal dan kurva standar.

PCR digital menggunakan deteksi titik akhir dan tidak bergantung pada nilai Ct (ambang siklus), sehingga reaksi PCR digital kurang dipengaruhi oleh efisiensi amplifikasi, dan toleransi terhadap penghambat reaksi PCR ditingkatkan, dengan akurasi dan reproduktifitas tinggi.

Karena karakteristik sensitivitas tinggi dan akurasi tinggi, tidak mudah diganggu oleh penghambat reaksi PCR, dan dapat mencapai kuantifikasi absolut yang sebenarnya tanpa produk standar, yang telah menjadi hotspot penelitian dan aplikasi.

Menurut berbagai bentuk unit reaksi, dapat dibagi menjadi tiga jenis: mikrofluida, chip dan sistem tetesan.