PCR langsung adalah reaksi yang langsung menggunakan jaringan hewan atau tumbuhan untuk amplifikasi tanpa ekstraksi asam nukleat.Dalam banyak hal, PCR langsung berfungsi seperti PCR biasa

Perbedaan utama adalah buffer khusus yang digunakan dalam PCR langsung, sampel dapat langsung dikenai reaksi PCR tanpa ekstraksi asam nukleat, tetapi ada persyaratan yang sesuai untuk toleransi enzim dan kompatibilitas buffer yang terlibat dalam reaksi PCR langsung.

Meskipun ada lebih banyak atau lebih sedikit penghambat PCR dalam sampel umum, PCR langsung masih dapat mencapai amplifikasi yang andal di bawah aksi enzim dan buffer.Reaksi PCR tradisional membutuhkan asam nukleat berkualitas tinggi sebagai templat, yang dapat menghambat kelancaran reaksi PCR jika templat tersebut mengandung protein dan pengotor lainnya.PCR langsung saat ini merupakan salah satu teknologi yang lebih populer di bidang diagnostik molekuler.

01 Direct PCR awalnya digunakan untuk hewan dan tumbuhan

Aplikasi paling awal dari PCR langsung adalah di bidang hewan dan tumbuhan, seperti darah, jaringan dan rambut tikus, kucing, ayam, kelinci, domba, sapi, dll., Daun dan biji tanaman, dll., Digunakan untuk mempelajari genotipe, transgenik, deteksi plasmid, analisis knockout gen, identifikasi sumber DNA, identifikasi spesies, analisis SNP, dan bidang lainnya.

Bidang-bidang ini memiliki beberapa ciri umum, yaitu kandungan gen target relatif tinggi dan ekstraksi asam nukleat menyusahkan, sehingga PCR langsung tidak hanya menghemat waktu dan berdampak kecil pada hasil, tetapi juga menghemat biaya.

PCR langsung yang digunakan untuk deteksi patogen adalah masalah beberapa tahun terakhir, beberapa produsen reagen PCR telah melakukan banyak upaya ke arah ini saat membuat inovasi.Terutama dalam epidemi COVID-19 ini, banyak produk pendeteksi seperti itu telah muncul di pasaran, seperti Kit Deteksi Asam Nukleat SARS-CoV-2 (Metode Probe Fluorescent PCR Multiplex) yang diteliti dan dikembangkan oleh Foregene, yang menggunakan teknologi Real-time RT PCR (rRT-PCR) untuk deteksi kualitatif asam nukleat SARS-CoV-2 dalam sampel swab nasofaring atau orofaring manusia.

Foregene adalah salah satu perusahaan yang menggunakan teknologi Direct PCR, untuk mendeteksi ORF1ab normal, N, E, danvarian garis keturunan asam nukleat dalam sampel swab nasofaring atau orofaring manusia seperti garis keturunan SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), garis keturunan B.1.351 (ZA), garis keturunan B.1.617 (IND) dan garis keturunan P.1 (BR).

02  Reagen diperlukan untuk PCR langsung

Sampel Lisat

Sampel lisat dapat dikonfigurasi sendiri atau dibeli.Perbedaan komposisi merek lisat yang berbeda akan membuat kemampuan lisis berbeda, dan kemudian waktu lisis akan sedikit berbeda.Misalnya, untuk penyiapan sampel jaringan hewan, lisis umumnya direkomendasikan selama 30 menit atau semalam, dan larutan lisis untuk virus berkisar antara 3-10 menit.

campuran induk PCR

Disarankan untuk menggunakan DNA polimerase hot-start untuk meningkatkan amplifikasi spesifik dan meningkatkan kemampuan amplifikasi.Inti dari PCR langsung adalah polimerase yang sangat toleran.

Hilangkan atau hambat komponen dalam sampel yang memengaruhi amplifikasi DNA

Setelah sampel diproses dengan lisat, protein, lipid dan sisa-sisa sel lainnya akan dilepaskan, zat ini akan menghambat reaksi PCR.Oleh karena itu, PCR langsung memerlukan penambahan penghilangan atau penghambat yang sesuai untuk mengurangi pengaruh faktor-faktor ini.

03  Kumpulan lima poin pengetahuan PCR langsung

Pertama, teknologi Direct PCR adalah teknologi PCR langsung untuk berbagai sampel biologis.Dengan kondisi teknis ini, tidak perlu memisahkan dan mengekstraksi asam nukleat, langsung menggunakan sampel jaringan sebagai objek, dan menambahkan primer gen target untuk melakukan reaksi PCR.

Kedua, teknologi Direct PCR tidak hanya teknologi amplifikasi template DNA tradisional, tetapi juga mencakup PCR transkripsi balik template RNA.

Ketiga, teknologi PCR Langsung tidak hanya secara langsung melakukan reaksi PCR kualitatif rutin pada sampel jaringan, tetapi juga mencakup reaksi qPCR Real-Time, yang membutuhkan sistem reaksi untuk memiliki kemampuan interferensi fluoresensi anti-latar belakang yang kuat dan memadamkan kemampuan antagonis fluoresensi endogen.

Keempat, sampel yang ditargetkan oleh teknologi Direct PCR hanya membutuhkan pelepasan template asam nukleat, dan tidak menghilangkan protein, polisakarida, ion garam, dll. yang mengganggu reaksi PCR.Yang membutuhkan polimerase asam nukleat dan Campuran PCR dalam sistem reaksi untuk memiliki ketahanan dan kemampuan beradaptasi yang sangat baik untuk memastikan aktivitas enzim dan akurasi replikasi dalam kondisi yang kompleks.

Kelima, sampel jaringan yang ditargetkan oleh teknologi Direct PCR tanpa perlakuan pengayaan asam nukleat dan jumlah templat sangat kecil, yang mengharuskan sistem reaksi memiliki sensitivitas dan efisiensi amplifikasi yang sangat tinggi.